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蛋白质的提取和分离[学习目标定位]1.简述蛋白质提取和分离的基本原理。2.总结在琼脂糖凝胶电泳中影响蛋白质迁移率的因素。3.进行乳酸脱氢酶同工酶的提取和电泳分离。第14课时本课栏目开关知识·储备区学习·探究区自我·检测区1．归纳蛋白质多样性的原因(1)图甲说明：______________不同，构成的肽链不同。(2)图乙说明：______________不同，构成的肽链不同。(3)图丙说明：________________不同，构成的肽链不同。(4)图丁说明：_____________________不同，构成的蛋白质不同。肽链的数目和空间结构氨基酸的种类氨基酸的数目氨基酸的排列顺序第14课时知识储备区本课栏目开关知识·储备区学习·探究区自我·检测区2．蛋白质有多种功能，如酶具有______作用、抗体具有______作用、激素具有______作用、血红蛋白具有_______作用等。3．酶的活性受多种因素影响，如______、pH、________或激活剂等。4．乳酸脱氢酶是一种糖酵解酶，能催化乳酸脱氢生成丙酮酸，几乎存在于所有组织中。抑制剂催化免疫调节运输温度第14课时知识储备区本课栏目开关知识·储备区学习·探究区自我·检测区探究点一电泳、同工酶和蛋白质组学带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳的种类多，应用非常广泛，它已成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。1．电泳(1)原理一些生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上正电或负电。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷____(相同、相反)的电极移动。因待分离样品中各相反第14课时学习探究区本课栏目开关知识·储备区学习·探究区自我·检测区种分子__________的差异以及分子本身的______、______不同。使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。(2)常用方法种类①琼脂糖凝胶电泳：在电泳缓冲液和凝胶中加入琼脂糖，蛋白质分子的迁移速率主要取决于其所带________以及分子的___________等。②变性胶电泳：在电泳缓冲液和凝胶中加入十二烷基硫酸钠(SDS)变性剂，蛋白质都变为______形，SDS带有大量的____电荷，掩盖了不同蛋白质的电荷差异，因此变性胶电泳中影响蛋白质的迁移速率的主要因素是蛋白质分子的_____。大小带电性质大小形状净电荷大小和形状椭圆负第14课时学习探究区本课栏目开关知识·储备区学习·探究区自我·检测区小贴士蛋白质的其他分离技术(1)凝胶色谱法第14课时学习探究区本课栏目开关知识·储备区学习·探究区自我·检测区①凝胶色谱法也称为分配色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。凝胶实际是一些微小的多空球体，大多数是由多糖类化合物构成的。②凝胶色谱法分离蛋白质的原理图A：相对分子质量较小的蛋白质由于扩散作用进入凝胶颗粒内部，路程较长，移动速度较慢而被滞留；相对分子质量较大的蛋白质被排阻在凝胶颗粒外面，在颗粒之间迅速通过。图B：a.蛋白质混合物上柱；第14课时学习探究区本课栏目开关知识·储备区学习·探究区自我·检测区b．洗脱开始，相对分子质量较小的蛋白质进入凝胶颗粒内；相对分子质量较大的蛋白质被排阻在凝胶颗粒之外；c．相对分子质量较小的蛋白质被滞留；相对分子质量较大的蛋白质向下移动；d．相对分子质量不同的蛋白质分子完全分开；e．相对分子质量较大的蛋白质行程较短，已从层析柱中洗脱出来，相对分子质量较小的蛋白质还在行进中。(2)透析法：将提取液放到用半透膜材料制成的透析袋内，放到磷酸缓冲液中，小分子的杂质能自由的扩散出透析袋，大分子蛋白质不能透过透析袋，保留在袋内。第14课时学习探究区本课栏目开关知识·储备区学习·探究区自我·检测区2．同工酶同工酶是指催化的化学反应相同，酶蛋白的分子______、_________乃至________性质不同的一组酶。乳酸脱氢酶一般含有____种同工酶，其相对分子质量______，但所带电荷_______。不同结构理化性质免疫学5相同小贴士同工酶存在于生物的同一种属或同一个体的不同组织、甚至同一组织或细胞中。产生同工酶的主要原因是在进化过程中基因发生变异，而其变异程度尚不足以成为一个新酶。第14课时学习探究区本课栏目开关知识·储备区学习·探究区自我·检测区3．蛋白质组学蛋白质组学指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的_____________分析、_________研究和蛋白质的__________等。由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生、细胞代谢等过程的整体而全面的认识。蛋白质组学的研究不仅能分析生物体内蛋白质的______，还可以揭示各种蛋白质在生物体内的__________________。相互作用与联系氨基酸组成立体结构人工合成组成第14课时学习探究区本课栏目开关知识·储备区学习·探究区自我·检测区归纳提炼琼脂糖凝胶电泳的优点(1)琼脂含液体量大，近似自由电泳；(2)琼脂作为支持体有均匀、区带整齐、分辨率高、重复性好等优点；(3)电泳速度快；(4)区带易染色，样品易回收，有利于制备；(5)操作简单、快速、灵敏。第14课时学习探究区本课栏目开关知识·储备区学习·探究区自我·检测区活学活用1．下列说法中，不正确的是()A．同工酶催化的化学反应相同，但结构不完全相同B．同工酶的相对分子质量一定不同C．蛋白质的多样性决定了其功能的多样性D．蛋白质组学是21世纪生命科学研究领域新的前沿解析同工酶催化的化学反应相同，但结构不完全相同，乳酸脱氢酶的5种同工酶的相对分子质量是相同的。B第14课时学习探究区本课栏目开关知识·储备区学习·探究区自我·检测区探究点二乳酸脱氢酶同工酶的提取和分离下面我们以乳酸脱氢酶同工酶的提取和分离为例，体验蛋白质的提取和分离技术。1．乳酸脱氢酶同工酶的提取(1)取5g新鲜的动物心脏，______干净后______到预冷的玻璃匀浆器中，加入25mL________________液，然后_________成匀浆(如图1)。冰浴研磨漂洗剪碎磷酸提取缓冲第14课时学习探究区本课栏目开关知识·储备区学习·探究区自我·检测区(2)将匀浆收集到冰浴的_____管中，在___℃条件下12000rpm离心10min。吸取_______，___℃条件下保存备用(如图2)。2．琼脂糖凝胶电泳分离(1)制备琼脂糖凝胶用______________液配制质量分数为1%的琼脂糖凝胶，__________后混匀，缓慢倒入胶床中，插入适当的梳子，室温冷却至凝胶凝固。拔出梳子，将凝胶放入电泳槽中，然后向电泳槽中加入适量________________液(如图3)。TBE电泳缓冲离心44上清液TBE电泳缓冲加热溶解第14课时学习探究区本课栏目开关知识·储备区学习·探究区自我·检测区(2)加样：取适量同工酶提取液与等量___________液(质量分数40%的蔗糖溶液、0.25%溴酚蓝)混匀，然后取20μL加入________内。(3)电泳：______V条件下电泳30min。(4)染色：当溴酚蓝指示剂电泳到___________时切断电源，取出胶板浸入________中，37℃染色15～30min，水洗后观察电泳结果。染色液载样缓冲样品孔100凝胶底部第14课时学习探究区本课栏目开关知识·储备区学习·探究区自我·检测区3．结果分析由图中电泳结果可以看出：(1)每个器官形成了__个条带说明_______________________。(2)LDH2在_____中含量最高，在________中含量最低，说明_____________________________________。(3)骨骼肌中含量最高的是_______，含量最低的是________，说明_________________________________。同一器官不同的同工酶含量不同5乳酸脱氢酶有5种同工酶心脏骨骼肌不同的器官同一种同工酶的含量不同LDH5LDH1第14课时学习探究区本课栏目开关知识·储备区学习·探究区自我·检测区4．实验讨论(1)提取和分离乳酸脱氢酶同工酶过程中为什么要保持酶的活性？答案酶作为一类特殊的蛋白质(具有生物催化活性)，在其提取和分离过程中必须保持其生物活性，这样分离出的酶才有可能用来研究其生化性质及相关功能。(2)制备乳酸脱氢酶同工酶提取液的过程中，哪些是为了保持酶活性而采取的措施？答案①提供必要的缓冲系统，以维持pH的相对稳定，防止破坏其活性；②保持低温环境，如将玻璃匀浆器和离心管预冷，低温离心；③避免引入其他杂质或变性剂，导致酶变性，如对材料进行漂洗。第14课时学习探究区本课栏目开关知识·储备区学习·探究区自我·检测区(3)溴酚蓝为什么能作为乳酸脱氢酶同工酶的指示剂？答案溴酚蓝能和乳酸脱氢酶同工酶发生特定的反应，形成特殊的蓝紫色产物。归纳提炼1．实验步骤概括取材→剪碎→漂洗→匀浆→离心→制凝胶→加样→电泳→染色→冲洗→观察。第14课时学习探究区本课栏目开关知识·储备区学习·探究区自我·检测区2．实验操作要点(1)所有提取乳酸脱氢酶同工酶用到的器具最好都提前在冰箱中预冷处理，这样能更好地保持酶的活性。(2)蛋白质样品在上样之前，要与等量载体缓冲液混匀。载样缓冲液中的蔗糖可增加蛋白质样品的比重，防止加样时发生“漂样”现象；溴酚蓝作为一种电泳前沿指示剂，判断电泳的进行程度。(3)将蛋白质样品加在电泳槽的负极段的加样孔，因为在碱性缓冲液中带负电荷的蛋白质在外加电场作用下会向正极移动。第14课时学习探究区本课栏目开关知识·储备区学习·探究区自我·检测区活学活用2．下列说法不正确的是()A．在酶的提取和分离过程中必须保持其生物活性B．将心脏研磨成匀浆时要在冰浴下进行，是为了保证酶的活性C．载样缓冲液中的溴酚蓝是一种酸碱缓冲物质，维持pH稳定D．电泳的结果是出现了5个条带，说明乳酸脱氢酶有5种同工酶第14课时学习探究区本课栏目开关知识·储备区学习·探究区自我·检测区答案C解析酶提取之后要进行一系列活性条件下的研究，因此在酶的提取和分离过程中必须保持其生物活性，将心脏研磨成匀浆时要在冰浴下进行，就是为了保证酶的活性。载样缓冲液中的溴酚蓝是一种指示剂，指示酶的迁移位置；电泳出现了5个条带说明乳酸脱氢酶有5种同工酶。第14课时学习探究区本课栏目开关知识·储备区学习·探究区自我·检测区带电性质大小慢快小分子匀浆电泳染色第14课时学习探究区本课栏目开关知识·储备区学习·探究区自我·检测区1．在乳酸脱氢酶同工酶分离过程中，使用缓冲液的作用是()A．维持溶液浓度不变B．维持溶液酸碱度不变C．催化蛋白质分离过程顺利完成D．无实际意义解析分离蛋白质时加入缓冲液，其原因是缓冲液在一定范围内能抵制外界酸和碱对反应溶液溶液pH的影响，保持pH基本不变。B第14课时自我检测区本课栏目开关知识·储备区学习·探究区自我·检测区2．乳酸脱氢酶有几种同工酶()A．2B．3C．4D．5解析乳酸脱氢酶的同工酶共有5种。D3．已知某样品中存在甲、乙、丙、丁、戊五种蛋白质分子，分子大小、电荷的性质和数量情况如图所示，下列有关蛋白质分离的叙述中，正确的是()第14课时自我检测区本课栏目开关知识·储备区学习·探究区自我·检测区A．若将样品以2000r/min的速度离心10min，分子戊在沉淀中，则丙也一定在沉淀中B．若用电泳法分离样品中的蛋白质，则分子丁移动速度最快C．将样品装入透析袋中透析12h，若分子丙保留在袋内，则乙也一定保留在袋内D．若用电泳分离样品中的蛋白质分子，则分子甲和分子丁形成的电泳带相距最远第14课时自我检测区本课栏目开关知识·储备区学习·探究区自我·检测区解析分子丙的相对分子质量大于戊，所以，在离心时戊存在于沉淀中，丙也一定在沉淀中，A项正确。电泳速度主要取决于颗粒大小、形状和净电荷多少，丁所带电荷及相对分子质量都是既不最多也不最少，所以B项错误。分子丙的相对分子质量大于乙，则丙保留在袋内，乙可能在袋外，C项错误。一般来说，带电颗粒直径越小，所带净电荷越多，