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疫苗免疫佐剂Vaccineadjuvant1Vaccineadjuvant自从1925年法国免疫学家Ranmon发现在疫苗中加入某些与之无关的物质可以特异性地增强机体的免疫反应以来,至今免疫佐剂的发展已近80年。•特点:•佐剂本身可以有抗原性；•也可以不具备抗原性。2Vaccineadjuvant•一、佐剂（Adjuvant）：•能非特异性地增强机体对抗原的特异性免疫应答，发挥•辅佐作用的物质。•佐剂作用：•使抗原缓慢释放•延长抗原在体内停留时间•扩大抗原的表面积•促进局部的炎症反应•增强吞噬细胞的吞噬与抗原提呈3vaccineadjuvant•二、佐剂的类型：•油水乳剂：矿物油、乳化剂•微生物及代谢产物：脂多糖、分支杆菌、霍乱毒素等•细胞因子：白介素、干扰素等•脂质体：胆固醇类•蜂胶：蜂蜜•人工合成：胞壁酰二肽4vaccineadjuvant•1.具备免疫原性的佐剂：如卡介苗、枯草分枝杆菌、短小•棒状杆菌、百日咳杆菌、脂多糖、细胞因子等。•2.不具备免疫原性的佐剂：如氢氧化铝佐剂、磷酸铝、磷•酸钙、石蜡油、羊毛脂、表面活性剂、藻酸钙、多聚核苷•酸、胞壁肽等。5vaccineadjuvant•应用最多的是福氏佐剂、细胞因子佐剂。•（1）福氏佐剂：•完全福氏佐剂（石蜡油+羊毛脂+卡介苗）、•不完全福氏佐剂（石蜡油+羊毛脂）两种。•（2）细胞因子佐剂：细胞因子佐剂与抗原合用，可有效激发机体的免疫功能。IL-2、IL-1、IFNγ、IL-12、GM-CSF。•经典的铝盐佐剂，在提高抗体水平和安全方面已获得长期的实践证实。人类疫苗基本采用此佐剂。6vaccineadjuvant•三、新型佐剂•油/水乳剂型；•颗粒型；•微生物衍生物型佐剂。7vaccineadjuvant•油/水乳剂型佐剂：•MF59、AS02、Montani2deISA251和ISA2720，是一类油•包水或水包油型乳化剂。•MF59是在高压条件下将鲨烯与Tween80和Span85混合后•进行微流化进而形成均一的小滴状乳液。•AS02是一种含有单磷脂A(MPL)和皂角苷(QS221)的油包•水乳剂,能诱导强烈的抗体应答并伴有Th1型和CTL反•应。8Vaccineadjuvant•颗粒型佐剂：•将抗原输送系统与疫苗抗原复配或融合后形成颗粒状物质，显微镜下呈颗粒状。铝盐氢氧化铝、磷酸铝等的不溶性胶状沉淀,颗粒大小100-1000nm,免疫原通过静电与胶结合。•安全性佳,靶向良好,贮存作用中等,诱导强Th2应答,常见强IgE应答,但诱导CTL和CM1作用很弱。价廉,易制备。9Vaccineadjuvant•新型颗粒型佐剂种类：•病毒颗粒(virosome)•聚乙交酯(PLG)微粒•免疫刺激复合体(immuneresponsestimulatincompISCOMs)•脂质DC-Chol10Vaccineadjuvant•病毒颗粒：是一种具有免疫增强作用的重构病毒样颗粒,是由病毒表面糖蛋白与磷脂嵌合形成的150nm脂蛋白体。•聚乙交酯(PLG)微粒：生物可降解和生物相容性的PLG是研究颗粒佐剂的主要材料,既可包裹抗原蛋白实现蛋白疫苗的投递,有效控制抗原的释放,也可作为DNA疫苗的有效佐剂。•ISCOMs微粒:皂苷、胆固醇和磷脂组成的复合物,形成直径约40nm球型结构,结构内的皂苷与胆固醇结合而不与细胞膜表面结合。已用于兽用疫苗。•脂质-胆固醇（DC-Chol）：胆固醇和磷脂组成的单层或多层脂双层膜囊结构，亲脂及两性分子与膜结合亲水分子包在膜内,脂质体将可溶性抗原转变成颗粒性抗原,其粒径大小、电荷和抗原结合能力可随不同组份比例而变化。11Vaccineadjuvant•非颗粒性佐剂•胞壁酞二肽及衍生物(MDP)：•分枝杆菌肽聚糖中具佐剂活性的部分，MDP为致热原,与其人工合成而无毒性的衍生物都可诱导IL-1。亲水性衍生物倾向刺激Th2,而亲脂性衍生物倾向刺激Th1。12Vaccineadjuvant•非离子阻断共聚物：•由疏水的聚氧丙烯和聚氧乙烯侧向联接而成,后者占5%-20%，分子量2500-12500。用作添加剂加入w/o或o/w的油相中能促进双性分子提呈,也有免疫调节作用,但不能生物降解而致注射局部反应。13Vaccineadjuvant•皂昔系：•从皂树Quillajasaponaria：树皮提取的三菇类混合物,QuillaA和spikoside为其部分纯化物,为精制物。皂昔能诱导对某些蛋白强和应答、中等应答,可能是由于生成了蛋白一皂昔混合小体的结果。•QuillaA已广泛用作兽用佐剂并提议用于人体,它价廉、安全、配制简单。•细胞因子一般为分子量约20KDa。14Vaccineadjuvant•碳水化合物聚合体：•甘露醇、b-3葡萄糖聚合物,与免疫原混合或结合可用作人疫苗佐剂刺激DC,诱导Th1应答。•多糖衍生物系：•高分子量硫酸葡聚糖或二乙氨乙基(DEAE)葡聚糖,已用于兽用疫苗。15Vaccineadjuvant霍乱毒素及其亚单位：•大肠杆菌不耐热毒素及其亚单位,•在动物实验中显示粘膜佐剂活性。它们可能是通过GM1神经节苷脂受体靶向作用和刺激内源性腺昔酸环化酶活性而起佐剂作用。16Vaccineadjuvant•微生物衍生物型佐剂：•微生物的核酸类,CpG寡脱氧核苷酸(CpG2ODN)佐剂,•非核酸类佐剂单磷脂A(MPL)、OM2174、不耐热肠毒素•(LT)及其突变体等。17•1.CpG-ODN佐剂•CpG-ODN是指一些以非甲基化的CpG•序列(CpGmotif)为核心的人工合成寡聚脱氧核苷酸(oligodeoxynucleotides,ODN)。•源于细菌DNA和特定序列反义寡核苷酸(ODN)的免疫刺激作用。含有特定未甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(CpG)序列。•未甲基化核苷酸细菌DNA序列是DNA具有免疫学活性关键,能给免疫系统提供一种危险信号,易被机体免疫系统的细胞识别。免疫系统通过对这些特定序列的识别,来诱发针对外源性DNA的免疫应答。18Vaccineadjuvant•CpG-ODN：•含有GTCGTT模体的CpG寡核苷酸,对人淋巴细胞具有良好的刺激活性。•能直接激活单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞等抗原提呈细胞,引起这些细胞分泌IL-12、TNF-α等Th1型为主的细胞因子,并刺激MHC-I与MHC-II类抗原表达增加。•IL-12协同下激活NK细胞,激活的NK细胞杀伤活性增强,并分泌IFN-γ,IFN-γ。•激活B细胞增殖分化分泌IL-6、IL-10等细胞因子和表达MHCII、B7—1、B7-2等表面分子,阻止B细胞的凋亡。•是一个新的不依赖于T细胞的激活途径。19Vaccineadjuvant•2.、MPL和OM2174均属于细菌脂多糖成分,•MPL：来源于明尼苏达沙门菌的脂多糖,含有6个脂肪酸;•OM2174：是一种经化学方法减毒的脂质A衍生物,仅保留了3个脂类分子,且纯度高,可溶于水,4℃下能稳定保存5年。•LT：来自于大肠杆菌属于细菌肠毒素,具有较强的粘膜佐剂活性。201984年Tokunaga最先发现结核分支杆菌的核酸具有抑制肿瘤的功能。之后的许多研究表明，很多细菌、病毒、非脊椎动物的DNA均有激活NK细胞和诱导干扰素分泌的生物学活性。1.TokunagaT,YamamotoH,Shimada,etal.Antitumoractivityof•deoxyribonucleicacidfractionfromMycobacteriumbovisBCG.I.•Isolation,physicochemicalcharacterizationandantitumoractivity.JNatlCancerInst,1984,72(4):955-962.21Yamamoto等发现，具有这一功能的DNA多以CpG为核心，属短非表达特异重复序列。通过不同基因的克隆和人工合成单链寡核苷酸等方法证明具有免疫激活作用的寡核苷酸特异序列是：AGCGCT、•AACGTT等。•这些序列均有CpG基序，其中的CpG特征结构以未甲基化的CpG二核苷为核心，5′端两个嘌呤，3′端两个嘧啶，即5′-PuPu-CpG-PyPy-3′序列2、YamamotoS,YamamotoT,TokunagaT,etal.DNAfrombacteria，butnotfromvertebtates,inducesinterferons,activitysnaturalkillercellsandinhibitstumorgrowth[J].MicrobiolImmunol,1992,36(9):983-997．223、司兴奎,陈建红,张济培,等．CpG寡脱氧核苷酸的免疫刺激特性及应用研究进展．动物医学进展,2008,29（7）：71-75．CpG-DNA可诱导强烈的Th1型免疫应答，增加细胞的T淋巴细胞（CTL）的活性，是一种强有力的DNA疫苗免疫佐剂23•大肠杆菌JM109细菌基因组DNA：CpG-DNA小鼠和人中有良好刺激作用的最适序列ODN-1826(GACGTT)和ODN-2006(GTCGTT)；•在大西洋鲑中有刺激活性的ODN-1670(AACGTT)；•对于具有免疫刺激活性：•CpG-DNA序列ODN-1670（5'-AACGTT-3'）CpG1670（含有一个ODN-1670），5'-ACCGATAAC•GTTGCCGGTGACG-3'，1670-D（含有两个ODN-1670）序列分别为：5'-ACCGATAACGTT•GCCAACGTTGGT-3'24Vaccineadjuvant•新型佐剂的免疫途径与方式•传统疫苗佐剂的投递主要是注射途径,类型单一。•新型疫苗佐剂：•投递途径多样,组成形式各异,佐剂活性更强,免疫重点突出等特点。•注射途径型佐剂、粘膜途径型佐剂，两者兼备型佐剂。25Vaccineadjuvant•油/水乳剂型佐剂：•以注射投递途径为主,包括MF59、QS21、AS02•以及Montanide等水包油或油包水型佐剂,这类佐剂通过肌肉或皮下注射接种来增强疫苗抗原的免疫原性,诱导特异的抗体反应,激发Th1型细胞因子(IFN2γ、IL-2等)产生较强的CTL反应,形成短暂性剧痛,引起局部强烈的炎症反应。•内源性细胞因子：如IL-2、IL-12、GM-CSF等,主要通过注射途径进行接种,所引发的免疫应答类型与油/水乳剂型佐剂相似。26Vaccineadjuvant•单纯的粘膜途径型佐剂：•LT和LT突变体为主,诱导以粘膜免疫为主的应答反应,分泌特异性sIgA,也可产生系统性免疫应答,虽然强度较注射途径弱。具有投递简便,无创伤等显著优点。•单一的注射途径或粘膜途径型佐剂在疫苗设计与使用上存在一定局限性。•具备两种投递功能的新型疫苗佐剂，不同的免疫途径下,既可诱导出系统免疫应答,也可产生粘膜免疫效果,既有体液免疫也有细胞免疫,达到免疫预防和免疫治疗的目的。27Vaccineadjuvant•新型佐剂的灵长类动物的临床前试验•乳剂型佐剂(QS221、AS02、ISA251等)、内源性免疫调节剂(IL-12、DC)以及微生物衍生物型佐剂(LT)已进入Ⅱ期临床试验;•微粒型佐剂(PLG、ISCOMs、DC-chol等)和多数微生物衍生物型佐剂(OM-174、CpG-ODN等)正处于Ⅰ期临床试验阶段；•MPL已开始Ⅲ期临床试验研究。28Vaccineadjuvant•MontanideISA佐剂：油包水或水包油乳剂•ISA51和ISA720,已有超过4000人接种过以此为佐剂的各种疫苗抗原来进行临床试验。•佐剂常用于肿瘤疫苗和HIV疫苗的研究,可诱导强烈的抗体应答和细胞免疫,但仍有个别试验者在接种ISA720后出现较强的局部副反应,反应出现频率具有抗原或剂量依赖性。29Vaccineadjuvant•DC-Chol新型脂质免疫刺激剂•用于幽门螺杆菌(H.pylori)和HIV疫苗的Ⅰ期临床试验。•结合H.pylori尿素酶抗原免疫健康人群；•结合HIVt