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一、基因工程的概念基因工程的别名基因拼接技术或DNA重组技术操作对象操作环境操作水平基本过程结果生物体外基因DNA分子水平剪切、拼接、导入、表达人类需要的基因产物基因工程：按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。基因拼接技术或DNA重组技术1、“基因剪刀”——限制性核酸内切酶二、基因操作的工具限制酶限制酶切开的是什么键？（左上与右下相同，左下与右上相同）磷酸二酯键限制性核酸内切酶•1）特点：•2）结果：•3）功能：•4）来源：专一性（即识别特定核苷酸序列，在特定的切点切割）产生黏性末端或平末端切开每条链中两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键原核生物左上与右下相同左下与右上相同磷酸二酯键磷酸二酯键2、要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？切断几个磷酸二酯键？可产生几个黏性末端？要切两个切口,切断四个磷酸二酯键，产生四个黏性末端。思考：1、限制性核酸内切酶与DNA水解酶相比有何不同？DNA水解酶将DNA分子水解成单个核苷酸，限制性核酸内切酶只能将DNA分子分解成特定的DNA片段2、末端特点？1、EcoRI、SmaI限制酶识别序列？切点？5’--A3’--TTCGAAGCTT--3’A--5’5’--CTGCA3’--GG--3’ACGTC--5’5’--AAT3’--TTAGGG--3’CCC--5’5’--CCC3’--GGGATT--3’TAA--5’2、“基因的针线”——DNA连接酶作用实质：结果：具有缝合DNA片段的作用（用同一种限制酶切开的不同来源的DNA的黏性末端之间的缝隙“缝合”起来）形成磷酸二酯键种类：E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶连接黏性末端既能连接黏性末端，又可以连接平末端DNA连接酶与DNA聚合酶异同？ATCATGGCTTAADNA连接酶CGCTTAAGAATTDNA聚合酶DNA连接酶DNA聚合酶相同点不同点模板作用对象作用结果用途DNA连接酶与DNA聚合酶的比较催化两个脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键不需要模板以DNA的一条链为模板游离的DNA片段单个的脱氧核苷酸形成完整的DNA分子形成DNA的一条链基因工程DNA复制运载体种类：质粒的特点：3、运载体－－能将外源基因送入细胞的工具（3）常含有标记基因（如：抗生素抗性基因、抗生素合成基因、固氮基因、色素基因）质粒、噬菌体可以将外源基因载入大肠杆菌等宿主细胞中，而植物病毒和动物病毒能够将外源基因分别带到植物细胞和动物细胞中质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒。（1）细胞质中能自主复制的小型双链环状DNA分子；以独立于染色体（或拟核DNA分子）之外的方式存在。（2）存在于许多细菌及酵母菌等生物体内（4）能在受体细胞中复制并稳定保存（5）具有一个至多个限制性核酸内切酶切点，供外源DNA片段插入•作为运载体必须具备哪些条件？1.能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。2.具多个限制酶切点，以便与外源基因连接。3.具有某些标记基因，便于进行筛选。如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。4.大小适中，便于操作。5.对宿主细胞无害、易分离。能自我复制并带着插入的目的基因一起复制有切割位点有标记基因的存在，将来可用含青霉素的培养基鉴别。1.以下说法正确的是（）A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列B、质粒是基因工程中唯一的运载体C、运载体必须具备的条件之一是：具有一个或多个限制酶切点，以便与外源基因连接D、DNA连接酶使黏性末段的碱基之间形成氢键C2、不属于质粒被选为基因运载体的理由是（）A、能复制B、有多个限制酶切点C、具有标记基因D、它是环状DNAD3、DNA连接酶催化的反应是()A．DNA复制时母链与子链之间形成氢键B．黏性末端碱基之间形成氢键C．两个DNA片段黏性末端之间的缝隙的连接D．A、B、C都不正确C4、作为基因的运输工具——载体，必须具备的条件及理由是()A、能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便于对目的基因进行筛选B、具有多个限制酶切点，以便于目的基因的表达C．具有某些标记基因，以便于进行筛选D、能够在宿主细胞中复制并稳定保存，以便为目的基因的插入C1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定第一步：目的基因的获取1、目的基因主要是指______________________编码蛋白质的结构基因2、方法：1)、人工合成2)、从基因文库中获取3)、利用PCR技术扩增(基因比较小，序列已知)基因文库基因组文库部分基因文库－－如：cDNA文库聚合酶链式反应反转录法：目的基因的mRNA杂交双链(单链RNA/单链DNA)单链DNA反转录酶DNA聚合酶双链DNA(目的基因)根据已知的氨基酸序列合成DNA法：蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列基因的脱氧核苷酸序列推测推测目的基因化学合成人工合成目的基因小结基因文库基因组文库部分基因文库（如:cDNA文库）基因文库？将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库从基因文库中获取目的基因受体菌的整个群体包含了这种生物的全部基因基因组文库的构建模式图基因组文库与部分基因文库的关系cDNA文库的构建模式图杂交双链(单链RNA/单链DNA)单链DNA反转录酶双链DNA(cDNA)某种生物的mRNA某种酶DNA聚合酶与载体连接后导入受体菌贮存，组成cDNA文库原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区启动子终止子内含子外显子启动子终止子真核细胞的基因结构非编码序列转录转录mRNA翻译多肽链初始mRNA剪接成熟mRNA翻译多肽链出核孔原核、真核基因表达比较①概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制________________的核酸合成技术③条件：_______________________、________、____________________、__________________.②原理：__________聚合酶链式反应体外特定DNA片段DNA复制已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸1对引物DNA聚合酶(Taq酶)利用PCR技术扩增目的基因变性复性延伸1.变性（90℃-95℃）双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成________氢键单链DNA2.复性(55℃-65℃)温度降低，与DNA模板结合，形成局部______。双链引物3.延伸（70℃-75℃）在的作用下，连接，合成与模板互补的DNA链。脱氧核苷酸Taq酶利用PCR技术扩增目的基因DNA复制PCR技术不同点解旋方式场所酶温度条件引物联系PCR技术与DNA复制的比较解旋酶催化高温变性解旋细胞内主要在细胞核内细胞外主要在PCR扩增仪内解旋酶、普通的DNA聚合酶等耐热的DNA聚合酶（Taq酶）细胞内温和条件需控制温度，在较高温度下进行需要（一对）不需要模板、原料均相同第二步：基因表达载体的构建（核心）2、基因表达载体的组成？①使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代②使目的基因能够表达和发挥作用启动子目的基因终止子标记基因1、基因表达载体构建的目的？（P162）抗生素抗性基因质粒DNA分子限制酶处理两个切口（位点）获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种一个切口(位点)两个黏性末端用相同的限制核酸内切酶分别切割目的基因和载体DNA（如质粒），目的基因和载体DNA的两端形成相同的黏性末端，在DNA连接酶的作用下，将目的基因和载体DNA连接在一起，形成重组DNA分子。它们有什么作用？a、目的基因b、启动子c、终止子d、标记基因位于基因的首端,是mRNA结合位点位于基因的末端,终止转录检测目的基因是否导入受体细胞抗生素抗性基因第三步：将目的基因导入受体细胞目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程转化——受体细胞稳定表达1、将目的基因导入植物细胞的方法：农杆菌转化法（1）农杆菌介绍：（2）适用范围及原理1、将目的基因导入植物细胞（1）农杆菌转化法特点:能感染双子叶植物和祼子植物,对单子叶植物无感染能力Ti质粒的T—DNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上转化过程:Ti质粒目的基因构建表达载体导入植物细胞插入植物细胞染色体DNA表达新性状转入农杆菌适用于双子叶植物裸子植物组织培养技术（2）基因枪法基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。适用于单子叶植物（3）花粉通道法植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。适用于被子植物2、将目的基因导入动物细胞方法:显微注射技术操作程序:提纯含目的基因表达载体取受精卵显微注射移植到子宫受精卵发育新性状动物3、将目的基因导入微生物细胞常用法：Ca2+处理（氯化钙），增加细胞壁的通透性常用菌：大肠杆菌微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少过程：Ca2+处理大肠杆菌感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达。•受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因完成了表达吗？若不能表达，要对抗虫基因再进行修饰。目的基因是否真正插入受体细胞的DNA中，是否能够在受体细胞中稳定遗传和正确表达，只有通过检测、鉴定才能得知。常用的检测手段主要从分子水平和个体水平进行。第四步：目的基因的检测与鉴定（一）分子水平1.检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因提取受体生物全部DNA适当限制酶切割DNA片段用同位素标记的目的基因片段杂交显出杂交带（表明目的基因已插入）分子杂交技术从转基因生物中提取的基因组DNA探针？杂交的对象？用放射性同位素标记的含目的基因的DNA片段DNA-DNA分子杂交2.检测目的基因是否转录出了mRNA提取受体生物的mRNA用同位素标记的目的基因片段杂交显出杂交带（表明目的基因已转录出了mRNA）用放射性同位素标记的含目的基因的DNA片段探针？杂交的对象？从转基因生物中提取的mRNA.DNA-mRNA分子杂交3.检测目的基因是否翻译出蛋白质抗原—抗体杂交提取受体生物的蛋白质与相应抗体杂交显出杂交带（表明目的基因已形成蛋白质产品）从转基因生物中提取的蛋白质抗原？抗体？将目的基因编码的蛋白质注射进动物体内进行免疫产生的相应抗体（二）个体水平例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。抗性鉴定（抗虫鉴定、抗病鉴定）、活性鉴定等目的基因的表达和检测小结个体接种实验（抗性鉴定）抗原－抗体杂交DNA-mRNA分子杂交DNA-DNA分子杂交受体是否具有转基因特征个体水平目的基因是否翻译目的基因是否转录目的基因是否导入分子水平方法检测对象6、1997年，科学家将动物体内的能够合成胰岛素的基因与大肠杆菌的DNA分子重组，并且在大肠杆菌中表达成功。请据右下图回答问题。(1)此图表示的是采取合成基因的方法获取基因的过程。(2)图中①DNA是以为模板，形成单链DNA，在酶的作用下合成双链DNA，从而获得了所需要的目的基因。(3)图中③代表，它往往含基因，以便对目的基因的检测。(4)图中④表示，为使此过程顺利进行，一般须将大肠杆菌用处理，以增大其细胞壁的。（5）图中⑤表示随大肠杆菌的繁殖而进行增殖，此目的基因在大肠杆菌内表达的标志是。逆转录目的控制胰岛素合成的信使RNA将目的基因导入受体细胞标记重组DNA分子氯化钙通透性目的基因大肠杆菌能产生人的胰岛素【例】科学家将人的生长激素基因与大肠杆菌的DNA分子进行重组，并成功地在大肠杆菌中得以表达。但在进行基因工程的操作过程中，需使用特定的限制性核酸内切酶切割目的基因和