s0131-脂质氧化mda检测试剂盒-说明书

脂质氧化(MDA)检测试剂盒产品编号产品名称包装S0131脂质氧化(MDA)检测试剂盒100次产品简介：碧云天的脂质氧化(MDA)检测试剂盒(LipidPeroxidationMDAAssayKit)采用一种基于MDA和硫代巴比妥酸(thiobarbituricacid,TBA)反应产生红色产物的显色反应，随后通过比色法用于对血浆、血清、尿液、动植物组织或细胞裂解液中MDA进行定量检测，广泛用于脂质氧化(lipidperoxidation)水平检测的试剂盒。丙二醛(Malondialdehyde,MDA)是一种生物体脂质氧化的天然产物。动物或植物细胞发生氧化应激(oxidativestress)时，会发生脂质氧化。一些脂肪酸氧化后逐渐分解为一系列复杂的化合物，其中包括MDA。此时通过检测MDA的水平即可检测脂质氧化的水平，因此MDA的测定被广泛用作脂质氧化的指标。生物体内的一些其它生化反应也会产生MDA，例如thromboxanesynthase也可以催化产生，但只要在测定时设置适当对照即可观察到脂质氧化水平的变化。丙二醛在较高温度及酸性环境中可与TBA发生反应，形成红色的MDA-TBA加合物，相应的反应原理图如下：MDATBAMDA-TBAAdductMDA-TBA加合物在535nm处有最大吸收，据此可以通过比色法进行检测。另外，MDA-TBA加合物也可以在535nm被激发产生最大发射波长553nm，据此也可以进行荧光检测。特点：本试剂盒中采用了特殊的抗氧化剂，可以有效地抑制样品在检测过程中产生新的MDA，使检测更加准确。同时本检测试剂盒在检测过程中可以把部分MDA天然形成的聚丙二醛分解成MDA，使对脂质氧化的测定更加准确。本试剂盒可以检测低达1μM的MDA。血浆、血清样品中的MDA含量通常在约2-4μM，尿液中的MDA含量通常在约5-30μM，在本试剂盒的检测范围内，可以直接用本试剂盒检测血浆、血清、尿液样品等。本试剂盒共可进行100次检测。包装清单：产品编号产品名称包装S0131-1TBA25mgS0131-2TBA配制液5mlS0131-3TBA稀释液15mlS0131-4抗氧化剂300μlS0131-5标准品(1mM)200μl—说明书1份保存条件：-20℃保存，一年有效。S0131-1TBA和S0131-4抗氧化剂需避光保存。S0131-1TBA、S0131-2TBA配制液和S0131-3TBA稀释液可室温或4℃存放三个月。注意事项：醛、较高浓度的可溶性糖(例如250mM蔗糖)对反应有干扰，可溶性糖与TBA显色反应的产物在532nm也有吸收(最大吸收在450nm)。如果可溶性糖对测定有干扰，可以通过测定450nm作为参考波长进行双波长测定，消除其干扰。为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。使用说明：1.样品的准备：a.血浆、血清或尿液样品制备后可以直接用于MDA测定。b.组织或细胞可以使用PBS或碧云天的Western及IP细胞裂解液(P0013)等裂解液进行匀浆或裂解。对于组织，组织重量占匀浆液或裂解液的比例为10%；对于细胞，每100万细胞使用0.1ml裂解液或匀浆液。匀浆或裂解后，1600g离心10分钟取上清用于后续测定。匀浆或裂解等样品制备步骤宜在冰浴或4℃进行操作。c.对于组织或细胞样品，样品准备完毕后可以用BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/P0012S)测定蛋白浓度，以便于后续计算单位蛋白重量组织或细胞内的MDA含量。d.本试剂盒对于样品中的常见化学成分的兼容性参考下表：试剂类别化学成分是否干扰缓冲试剂Borate(50mM)否HEPES(100mM)否Phosphate(100mM)否Tris(25mM)否去垢剂CHAPS(≤1%)否TritonX-100(≤1%)否Tween20(≤1%)否抑制剂/螯合剂Antipain(≤100μg/ml)否Chymostatin(≤10μg/ml)否Leupeptin(≤10μg/ml)否PMSF(≤200μM)否Trypsin(≤10μg/ml)否EDTA(≤1mM)否EGTA(≤1mM)否其它试剂Sucrose(250mM)是Glycerol(≤10%)否2.试剂盒的准备工作：a.TBA储存液的配制：称取适量TBA，用TBA配制液配制成浓度为0.37％的TBA储存液。例如18.5mgTBA用5mlTBA配制液配制，最终浓度即为0.37%。TBA配制液需完全溶解后再使用，可以加热到70℃以促进溶解。TBA储存液较难溶解，需加热到70℃，并通过剧烈Vortex以促进溶解。配制好的TBA储存液室温避光保存，至少3个月内有效。b.MDA检测工作液的配制:根据待测定的样品数(含对照)，参考下表在临检测前新鲜配制适量的MDA检测工作液检测次数1次10次20次50次TBA稀释液150μl1500μl3000μl7500μlTBA储存液50μl500μl1000μl2500μl抗氧化剂3μl30μl60μl150μl注意:MDA检测工作液较难溶解，可以70℃加热，并剧烈Vortex以促进溶解。也可以通过超声处理以促进溶解。配制好的MDA检测工作液必须当天使用。c.标准品的稀释：取适量标准品用蒸馏水稀释至1、2、5、10、20、50μM，用于后续制作标准曲线。3.样品测定:a.在离心管或其它适当容器内加入0.1ml匀浆液、裂解液或PBS等适当溶液作为空白对照，加入0.1ml上述不同浓度标准品用于制作标准曲线，加入0.1ml样品用于测定；随后加入0.2mlMDA检测工作液。可参考下表设置检测反应体系：空白对照标准品样品匀浆液、裂解液或PBS0.1ml－－标准品－0.1ml－待测样品－－0.1mlMDA检测工作液0.2ml0.2ml0.2mlb.混匀后，100℃或沸水浴加热15分钟。加热时务必注意避免液体暴沸溅出。如果使用加热块(Heatblock)进行加热注意用重物压紧离心管盖；如果使用沸水浴，则需使用可把盖子锁死的离心管或螺旋盖离心管，或用Parafilm封住离心管口，用针头刺一小孔。最方便和准确的加热方法是使用带有热盖并可以加热0.5mlPCR管的PCR仪。c.水浴冷却至室温，1000g室温离心10分钟。取200微升上清加入到96孔板中，随后用酶标仪在532nm测定吸光度。如果不方便测定532nm的吸光度，也可以测定530-540nm之间的吸光度。可以设定450nm为参考波长进行双波长测定。d.MDA含量的计算：对于血浆、血清或尿液等样品可以直接根据标准曲线计算获得MDA的摩尔浓度，对于细胞、或组织样品，计算出样品溶液中的MDA含量后，可以通过单位重量的蛋白含量或组织重量等来表示最初样品中的MDA含量，例如μmol/mg蛋白或μmol/mg组织。常见问题：1.没有检测到MDA。可能样品中MDA浓度过低，在检测限之下。在检测组织或细胞的MDA时，请注意使用更多的组织或细胞。并注意尽量不要稀释样品。使用本产品的文献：1.QianJ,JiangF,WangB,YuY,ZhangX,YinZ,LiuC.OphiopogoninDpreventsH2O2-inducedinjuryinprimaryhumanumbilicalveinendothelialcells.JEthnopharmacol.2010;128(2):438-45.Epub2010Jan18.