免疫荧光技术常见问题及分析

免疫荧光技术常见问题及分析免疫荧光技术(Immunofluorescencetechnique)又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。主要是利用荧光标记的抗体与待测抗原间反应进行抗原或者半抗原物质定位的技术。本文总结了免疫荧光技术常见的问题及解析。1、问：近期要做免疫荧光双标，不知哪位有免疫荧光双标技术的详细步骤及其注意事项?参考见解：我正在做冰冻组织切片的免疫荧光双染。我的经验是：(1)选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabbit和rat的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkeyanti-rabbit-FITC(绿)和donkeyanti-rat-Tex-Red(红)。(2)我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要仔细摸索，我感觉一抗4度孵育过夜比较好，背景比较清晰。(3)我的阳性对照用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。(4)封闭血清与二抗来源动物一致，我用的是10%的正常donkey血清。(5)其余步骤同一般免疫荧光单标操作。2、问：用免疫荧光方法做组织切片和培养细胞内的蛋白，两者操作过程有哪些不同?参考见解：只是固定方法不同。细胞固定用甲醇，切片固定用多聚甲醛，而染色方法是一样的。3、问：本人拟做Brdu标记神经干细胞免疫荧光，二抗为FITC标记，想请教各位大侠：(1)抗体分装和荧光显微镜观察时是否一定要在暗室中进行?(2)封片时是否用甘油缓冲液即可，还是用甘油和0.5mmol/LpH9.0-9.5的碳酸氢盐缓冲液等量混合封片?(3)免疫酶染色中的3%过氧化氢及2N盐酸是否还需要用?参考见解：(1)你的二抗是用FITC标记的，为避免荧光分解，分装及荧光显微镜观察时均要避光;(2)封片最好用甘油加0.5mmol/LpH9.0-9.5的碳酸氢盐缓冲液，后者能使玻片透明;(3)关于免疫酶染色，如果是用过氧化物酶做标记，就必须用3%H2O2以去除内源性过氧化物酶;2N盐酸需要使用，目的是使DNA变性，让Brdu抗体能够充分地与已经掺入的Brdu结合。4、问：做间接法免疫荧光染色，如何设置对照?参考见解：最好是同一视野在未用荧光激发下进行对照，看是否非特异性染色。(1)空白对照：如果你做的是石蜡切片免疫组化，这个对照必须有，目的是看自发荧光，脱蜡后直接在荧光显微镜下观察。(2)阴性对照：标本直接滴加二抗，呈阴性反应。(3)抗原对照：标本加同种动物的未免疫血清，以PBS冲洗后，在加抗免疫球蛋白荧光抗体。因未免疫动物的血清中无特异性抗体，应呈阴性反应。5、问：我做乳腺组织的免疫荧光染色，结果用激光共聚焦显微镜看很好：有阳性信号，阴性对照组也没有荧光，但是拿到荧光显微镜下看，我的阴性对照组一片绿，像非特异性染色，到底哪个结果才是真实的呢?参考见解：激光共聚焦显微镜的分辨率比普通荧光显微镜要高的多，出现上述现象首先要排除荧光显微镜的问题，如是不是紫外灯泡寿命到期了或者别的原因，荧光显微镜没有问题，那就以共聚焦显微镜的结果为主。免疫标记法可分为以下几类：荧光免疫法、放射免疫法、酶联免疫法(ELISA)、偶联生物素—亲和素系统的酶免法、时间分辨荧光免疫分析、解离增强镧系元素荧光免疫分析。免疫荧光实验的主要步骤包括细胞涂片的制备、细胞的固定及通透(或称为透化)、细胞封闭、一抗和二抗抗体孵育及荧光检测等。