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郑用链分子生物学综合复习题08基础兽医学邹晓冬（基准实验室，HZAU）-1-分子生物学综合复习题第1章绪论第2章基因的概念1.BasicConcepts重复基因（duplicatefactor）：即在基因组中有多个拷贝的基因——在真核生物基因组中发现这种现象，真核生物中的重复基因可以达到30%。重复基因主要是为了满足生物体快速发育的需要。断裂基因/不连续基因(Splitgenes/interruptedordiscontinusgenes）：即在基因编码蛋白质的序列中插入与蛋白质编码无关的DNA间隔区，使一个基因分隔成不连续的若干区段。跳跃基因/转座子（Jumpinggene/Transposableelement）：即可移动的或可转移的遗传因子。——这些因子不仅存在于细菌中，同时也存在于较高等的动物中。假基因(Pseudogenes)：是基因组中与编码基因序列非常相似的非功能性基因组DNA拷贝,一般情况都不被转录,且没有明确生理意义。——根据其来源可分为：保留了间隔序列的复制假基因（如珠蛋白假基因家族）和缺少间隔序列的已加工假基因。重叠基因(overlappinggene)：指在同一段DNA顺序上，由于阅读框架不同或终止早晚不同，同时编码两个以上基因的现象。2.Know-How的一级、二级和高级结构（一）核酸的一级结构核酸的碱基顺序是核酸的一级结构。多聚核苷酸是由四种不同的核苷酸单元按特定的顺序组合而成的线性结构聚合物，因此，它具有一定的核苷酸顺序，即碱基顺序。DNA的碱基顺序本身就是遗传信息存储的分子形式。生物界物种的多样性即寓于DNA分子中四种核苷酸千变万化的不同排列组合之中。（二）DNA的二级结构（1）DNA分子由两条多聚脱氧核糖核苷酸链(简称DNA单链)组成。两条链沿着同一根轴平行盘绕，形成右手双螺旋结构。螺旋中的两条链方向相反，即其中一条链的方向为5′→3′，而另一条链的方向为3′→5′。（2）嘌呤碱和嘧啶碱基位于螺旋的内侧，磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直，糖基环平面与碱基环平面成90°角。（3）螺旋横截面的直径约为2nm，每条链相邻两个碱基平面之间的距离为3.4nm，每10个核苷酸形成一个螺旋，其螺矩（即螺旋旋转一圈）高度为3.4nm。（4）两条DNA链相互结合以及形成双螺旋的力是链间的碱基对所形成的氢键。碱基的相互结合具有严格的配对规律，即腺嘌呤（A）与胸腺嘧啶（T）结合，鸟嘌呤（G）与胞嘧啶（C）结合，这种配对关系，称为碱基互补。A和T之间形成两个氢键，G与C之间形成三个氢键。在DNA分子中，嘌呤碱基的总数与嘧啶碱基的总数相等。DNA二级结构的多型性A-DNA（碱基平面不再与螺旋轴垂直，而是位于大沟中，RNA-RNA/DNA杂交分子具有这种结构）B-DNA(典型的Watson-Crick双螺旋，碱基平面基本上与螺旋轴垂直)C-DNA：D-DNAE-DNA这些不同构象的DNA都有共同之处：都是右手双螺旋；两条反向平行的核苷酸链通过Ｗatson-Crick碱基配对结合在一起；链的重复单位是单核苷酸；这些螺旋中都有两个螺旋沟，分为大沟与小沟，只是它们的宽窄和深浅程度有所不同。三股螺旋DNA通常是一条同型寡核苷酸与寡嘧啶核苷酸-寡嘌呤核苷酸双螺旋的大沟结合。郑用链分子生物学综合复习题08基础兽医学邹晓冬（基准实验室，HZAU）-2-（三）DNA的三级结构指DNA链进一步扭曲盘旋形成超螺旋结构。超螺旋是DNA三级结构的主要形式。所有的DNA超螺旋都是由DNA拓扑异构酶产生。DNA分子具有相同的结构，但链环数不同，所以称它们为拓扑异构体。拓扑异构酶能够催化它们之间的转换。DNA拓扑异构酶(topoisomeraseI,II)有两类（1）拓扑异构酶Ⅰ：作用是暂时切断一条DNA链，形成酶-DNA共价中间物而使超螺旋DNA松弛化，然后再将切断的单链DNA连接起来，而不需要任何辅助因子。如：大肠杆菌的ε蛋白(MW-110000)就是一种典型的拓扑异构酶Ⅰ。（2）拓扑异构酶Ⅱ：能将负超螺旋引入DNA分子，该酶能暂时性地切断和重新连接双链DNA，同时需要ATP水解为ADP以供能。如：大肠杆菌中的DNA旋转酶(DNAgyrase)。环状DNA的拓扑学特征（1）链环数（linkingnumber,DNA双链分子的交叉数）：指在双螺旋DNA中，一条链以右手螺旋绕另一条链缠绕的次数，以L表示。L①是整数；②在cccDNA中任何拓扑学状态中其值保持不变；③右手螺旋对L取正值。（2）初级螺旋圈数（缠绕数twistingnumber）：指DNA分子中Watson-Crick的螺旋数，以T表示。①可以是非整数；②是变量；③右手螺旋时T为正值。（3）超螺旋数（writhingnumber）以W表示。①可以是非整数；②是变量；③右手螺旋时，W取负值。举例说明这三者之间的关系：L=T+W如有松弛的B-DNA，共有420bp，一条链绕另一链42次，正好形成42圈螺旋，则L=T=42，所以W=0，无超螺旋。若固定一端，另一端按顺时针方向旋转6圈，使双螺旋解开6圈，再将双链连接成闭合环，而DNA仍要保持B-DNA的结构，每个螺旋由10个bp组成，T又变成最初的42，即有42个螺旋，则L=36，T=42，所以W=-6，即形成了6个负超螺旋（右旋），在此情况下，T值保持不变。（四）生物体内的超螺旋（1）环状DNA的超螺旋：大肠杆菌DNA是环状分子，整个分子长达1mm多，在体内压缩成1um直径的小体，包含了几个独立的超螺旋。（2）真核生物的染色体(chromosome)中的DNA染色单体由一条连续的DNA长链，经过四级盘旋、折叠而成。——一条DNA的长链经过一级结构即形成核小体后，其长度被压缩7倍；二级结构，即形成螺旋管后，DNA长度又被压缩了6倍；三级结构,即由螺线管形成超螺线管后,DNA的长度在二级结构的基础上被压缩了40倍；在由三级到四级结构,即形成染色单体后，DNA的长度在三级结构的基础上被压缩了5倍。因此由一条DNA长链,经过多级螺旋化，可以使几厘米长的DNA与组蛋白等物质共同形成几微米长的染色体，其长度总共被压缩8000～10000倍。核小体(nucleosomes)由H2A、H2B、H3、H4各两个分子生成的八聚体和由大约200bpDNA组成。八聚体在中间，DNA分子盘绕在外，而H1则在核小体的外面。核小体的组装能导致DNA的超螺旋化。端粒（telomere）是真核生物线形染色体的末端具有的一种特殊结构。真核生物染色体的天然末端，是细胞必需的遗传组分，因为它能够补偿染色体末端遗传信息的丢失。端粒是染色体末端的DNA重复序列，作用是保持染色体的完整性。细胞分裂一次，由于DNA复制的原因，端粒就缩短一点。一旦端粒消耗殆尽，染色体则易于突变而导致动脉硬化和某些癌症。因此，端粒和细胞老化有明显的关系。一直以来都知道精、卵细胞的端粒比成年体细胞的都长许多。在体内稳定存在的因素：氢键、磷酸酯键、碱基堆积力(非特异性结合力)、疏水作用力。★氢键为弱键,可加热解链；磷酸酯键为强键,需酶促解链。★0.2mol/LNa+生理盐条件，可消除DNA单链上磷酸基团间的静电斥力。（1）DNA分子中非极性的嘌呤、嘧啶环（-NH2等）使有序的以氢键连接的水分子层绕，熵值降低。（2）DNA分子中非极性碱基的聚集，使有序的水分子层绕减低到最低的限度，减少熵值的降低。（3）磷酸基团间的静电斥力。（4）碱基间的挤压、抵御使其内能增加,碱基间有序排列的状态破坏（氢键作用力被减弱）。郑用链分子生物学综合复习题08基础兽医学邹晓冬（基准实验室，HZAU）-3-的变性和复性，核酸分子杂交(一)核酸的变性（Denaturation）指核酸双螺旋区的多聚核苷酸链间的氢键断裂，变成单链结构的过程。变性核酸将失去其部分或全部生物活性。核酸的变性并不涉及磷酸二酯键的断裂，所以它的一级结构(碱基顺序)保持不变。能够引起核酸变性的因素很多。温度升高、酸碱度改变、甲醛和尿素等的存在均可引起核酸变性。监测DNA是否变性的一个最常用的指标是DNA在紫外区260nm波长处的吸收光值变化。因为DNA变性时，DNA双链发生解离，共轭双键更充分暴露，故DNA变性，DNA在260nm处的吸收光度值增加，并与解链程度有一定的比例关系，这种关系叫做DNA的增色效应。DNA的变性从开始到解链完全，是在一个相当窄的温度内完成的，在这一范围内，紫外光吸收值增加达到最大增加值的50％时的温度叫做DNA的解链温度（Tm）。一种DNA分子的Tm值的大小与其所含碱基中的G＋C的比例相关也与DNA分子大小及变性条件有关，G+C的比例越高，DNA分子越长，溶液离子强度越高，Tm值越大。常用的DNA变性方法（1）热变性方法：缺点是高温可能引起磷酸二酯键的断裂，得到长短不一的DNA。（2）碱变性方法：pH11.3时，可淘汰全部氢键，DNA完全变成单链。（3）维持单链状态：pH11.3或盐浓度0.01mol/L。（二）DNA的复性(Renaturation)——复性机制：10-20bp成拉链。（有减色效应）指变性DNA在一定条件下恢复成天然DNA结构的过程。（热变性的DNA可通过缓慢冷却而复性----分子生物学中也称为退火。）一般认为，比Tm值低25℃的温度是DNA复性的最佳条件。★热变性DNA在缓慢冷却时可以复性，快速冷却不能复性。DNA★片段越小、浓度越大，复性越快；复性条件：（1）有足够的盐浓度以消除磷酸基的静电斥力：0.15~0.5mol/LNaCl。（2）有足够高的温度以破坏无规则的链内氢键(但不能太高,否则配对碱基之间的氢键又难以形成)一般：低于Tm20~25C的温度。（三）DNA分子的杂交（molecularhybridization）是用一个DNA或RNA单链与另一被测DNA单链形成双链，以测定某特异序列是否存在的方法。这种方法已成为遗传学和分子生物学等生命学科中最为普遍和重要的方法之一。分子杂交的方法多种多样，但其共同特点是：①都是应用复性动力学原理；②都必须有探针（probe）的存在。——所谓探针就是用同位素或非同位素如荧光染料，生物素等标记的短片段特异DNA或RNA序列。分子杂交的方法（1）原位分子杂交（insituhybridization）①玻片原位杂交：进行染色体的基因定位，或观察组织中不同的RNA的分布。②膜上原位杂交：在基因文库中钓基因。（2）斑点杂交（dotblotting）：也叫狭缝杂交。由Southernblot衍生而来。它是将某种生物的总DNA直接点在尼龙膜上，或者通过一个小的长形狭缝印在尼龙膜上，后将膜变性处理，预杂交后，经中和、洗脱、干燥。再将其和探针放入复性缓冲溶液中缓缓复性，洗涤干燥后进行放射自显影，观察结果。这种方法是用来初步探测某种生物中含有一种特殊的基因或序列。用以分析DNA样品之间的同源性。（3）Northern杂交----检验RNA：提取某种生物或组织的总RNA或mRNA，用含有变性剂的琼脂糖凝胶电泳分离RNA，分离后再将凝胶上的RNA带吸印到尼龙膜上，在液相中和标记的核酸探针进行杂交，用此方法可以测定某基因表达的时空特异性（4）基因芯片(Genechip)技术：是指通过微阵列(Microarray)技术将高密度DNA片段阵列通过高速机器人或原位合成方式以一定的顺序或排列方式使其附着在如玻璃片等固相表面，以荧光标记的DNA探针，借助碱基互补杂交原理，进行大量的基因表达及监测等方面研究的最新革命性技术。DNA芯片为生物芯片的一种。郑用链分子生物学综合复习题08基础兽医学邹晓冬（基准实验室，HZAU）-4-生物芯片包括：DNA芯片、蛋白质芯片、其它芯片。按制备方式分：（1）原位合成芯片：采用显微光蚀刻等技术在特定部位原位合成寡核苷酸而制备的芯片。探针较短。（2）DNA微集阵列：将预先制备的DNA片段以显微打印的方式有序地固化于支持物表面而制成的芯片。探针的来源较灵活。DNA芯片的应用（1）DNA测序、杂交测序（SBH）；（2）基因表达分析；（3）基因组研究：作