植物组织培养

植物组织培养Planttissueculture目录第一章实验设备及技术第二章外植体的选择与灭菌第三章外植体的接种培养与驯化•植物组织培养是二十世纪发展起来的新技术，近几十年来，由于组培基础理论的研究深入，发展极为迅速，几乎以植物为研究对象的各个分支学科都在广泛进行组培。•定义：•是指植物的任何器官、组织或细胞，在人工控制的条件下，放在含有营养物质和植物生长调节物质等组成的培养基中，使其生长、分化形成完整植株的过成。一、植物组织培养的分类及相关概念•1根据培养的对象不同，可分为：•器官培养（organculture）•组织培养（meristemculeure）•胚胎培养（embryoidculeure）•细胞培养（cellculeure）•原生质体培养（protoplastculeure）•2根据培养过程不同，分为•初代培养（primaryculture）•继代培养（subculture）•3根据培养基物理状态，分为•固体培养（solidculture）•液体培养（liquidculture）•4相关概念（1）外植体（explant）：由活体（invivo）上提取下来的，接种在培养基上的无菌细胞、组织、器官等。（2）愈伤组织（callus）：在人工培养基上由外植体形成的一团无序生长状态的薄壁细胞。（3）分化（differentiation）：指由受精卵或胚状体经细胞分裂，引起极性生长形成根、茎、叶、花等不同组织器官的过程。（4）脱分化（dedifferentiation）：由高度分化的植物组织或器官产生无分化状态的愈伤组织的过程。（5）再分化（redifferentiation）：将脱分化形成的愈伤组织转移到适当的培养基上继续培养，这些无定形的愈伤组织又会重新分化出根、茎、叶、花形成完整植株的过程。二、植物组织培养的理论依据及特点•（一）理论依据植物细胞的全能性（totipotency）：是指植物体任何一个细胞都携带着一套发育成完整植株的全部遗传信息，在离体培养条件下，这些信息可以表达，产生出完整植株。•原理：生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质，都有发育成为完整个体所必须的全套基因，从理论上讲，生物体的每一个活细胞都应该具有全能性。•差异：（1）受精卵的全能性最高（2）受精卵分化后的细胞中，体细胞的全能性比生殖细胞低。•（二）植物组织培养过程：植物体（分离）外植体（脱分化）愈伤组织（再分化）生长点完整植株（具有幼根、幼茎）（三）植物组织培养条件：含有全部营养成分的培养基、一定的温度、空气、无菌环境、适合的PH、适时的光照。（四）外植体生长和分化途径：1.器官发生途径：A.由分生组织直接分生芽。B.由分生组织形成愈伤组织，经过再分化形成完整植株。2.胚状体发生途径：由游离的细胞或原生质体形成胚状体（embryoid），直接重建完整植株，或制成人工种子后重建植株。•（五）植物组织培养的特点1、优越性：可以在不受植物体其他部分干扰的情况下研究被培养部分（外植体）的生长和分化规律。2、特点：（1）取材少，培养材料经济；（2）人为控制培养条件，不受自然条件影响；（3）生长周期短，繁殖率高；（4）管理方便，利于自动化控制。•3、重要性：（1）理论上：是研究细胞学、遗传学、育种学、生物化学和药物学等学科的重要手段。（2）生产上：在农学、园艺、林业和次生代谢物工程等生产领域得到广泛应用。三、植物组织培养的发展历史•1902年，德国植物学家Haberlandt提出细胞全能性的概念。•1904年，E.Hanning培养萝卜和辣根菜属的一种植物的胚，使其发育成熟。•1908年，S.simon研究培养白杨嫩茎，观察到愈伤组织的发生和根芽的形成。•1958年，美国科学家Steward等和德国Reinert分别用胡萝卜根细胞诱导形成胚状体，使细胞全能性得到证实，为组织培养技术程序奠定了基础。•1960年，E.C.cocking采用纤维素酶,果胶酶等酶制剂分离番茄幼根，获得大量健康的原生质体。•1962年，Murashige和Skoog在烟草培养中筛选出至今仍然被广泛使用的MS培养基。•1964年，印度科学家S.Guha和Msheshwari培养南洋金花未成熟的花药时，发现了由大量胚状体形成的小植株（单倍体植株）。•罗士韦是我国植物组织和细胞培养研究的开拓者和奠基人之一。在30年代即开始离体根的培养，随着又进行幼胚和茎尖的培养。•70年代初期开始，我国掀起了单倍体育种的高潮，在小麦、水稻、烟草、玉米、三叶橡胶等作物上取得了一批有意义的成果。•80-90年代，全国研究工作内容明显倾向无性系的快速繁殖，许多机构开始转向应用，成为生产实体，如甘蔗、草莓、葡萄、菠萝、香蕉，各色观赏植物等。•现在，我国在原生质体培养，体细胞杂交、突变体筛选、去除病毒、次生代谢物的发酵生产、人工包装超级种子等方面都有了进步。四、植物组织培养的应用•1、快速繁殖：运用组织培养途径，一个植株一年可以繁殖几万到几百万个植株，例如，一株葡萄一年繁殖3万多株，一株兰花一年繁殖到400万株。•2、种苗脱毒：针对病毒对农作物造成的严重危害，通过组织培养可以有效地培育出大量的无病毒种苗，已经取得的有马铃薯、草莓、香蕉、葡萄等。•3、远缘杂交：利用组织培养可以使难度很大的远缘杂交取得成功，从而育成一些罕见的新物种。•4、突变育种：采用组织培养可以直接诱变和筛选出具抗病毒、抗盐、高赖氨酸、高蛋白等优良性状的品种。•5、基因工程：基因工程主要研究DNA的转导，而基因转导后，必须通过组织培养途径才能实现植株再生。•6、生物制品：有些极其昂贵的生物制品，比如抗癌首选药物—紫杉醇等，可以用大规模培养植物细胞来直接生产。第一章实验设备及技术第一节实验室植物组织培养是在严格的无菌的条件下进行的，同时还需要人工控制温度、光照、湿度等培养条件。1、实验室设计原则：保证无菌操作，达到工作方便，防止污染。2、实验室组成：化学实验室、洗涤灭菌室、无菌操作室（接种室）、培养室、细胞学实验室、移栽大棚。•化学实验室（准备室）：完成所使用的各种药品的贮备、称量、溶解、配制、培养基分装等。主要设备：药品柜、防尘橱（放置培养容器）、冰箱、天平、蒸馏水器、酸度计及常用的培养基配制用玻璃仪器。•洗涤、灭菌室：完成各种器具的洗涤、干燥、保存、培养基的灭菌等。主要设备：水池、操作台、高压灭菌锅、干燥灭火器（如烘箱）等。•无菌操作室（接种室）：主要用于植物材料的消毒、接种、培养物的转移、试管苗的继代、原生质体的制备以及一切需要进行无菌操作的技术程序。主要设备：紫外光源、超净工作台、消毒器、酒精灯、接种器械（接种镊子、剪刀、解剖刀、接种针）等。接种室宜小不宜大，一般7~8平米，要求地面、天花板及四壁尽可能密闭光滑，易于清洁和消毒。配置拉动门，以减少开关门时的空气扰动。•接种室要求干爽安静，清洁明亮，在适当位置吊装1~2盏紫外线灭菌灯，用以照射灭菌。最好安装一小型空调，使室温可控，这样可使门窗紧闭，减少与外界空气对流。•接种室应设有缓冲间，面积为1m²为宜。进入无菌操作室前在此更衣换帽，以减少进出时带入接种室杂菌。缓冲间最好也安装一盏紫外线灭菌灯，用以照射灭菌。•培养室：培养室是将接种的材料进行培养生长的场所。其设计以充分利用空间和节省能源为原则。高度比培养架略高为宜，周围墙壁要求有绝热防火的性能。•培养材料放在培养架上培养。培养架大多有金属制成，一般设5层，最低一层离地面高约10cm，其他每层间隙30cm左右，培养架即高1.7m左右。培养架的长度是根据日光灯的长度而设计的，如采用40W的日光灯，则长1.3m，30W的长度为1m，宽度为60cm。•培养室最重要的因子是温度，一般保持在20~27°C左右，具备产热装置，并安装窗式或立式空调机。•室内湿度也要求恒定，相对湿度以保持在70%~80%为好，可安装加湿器。•控制光照时间可安装定时开关钟，一般需要每天光照10~16小时，也有的需要连续照明。•现代组培实验室大多设计为采用天然太阳能作为主要能源，这样不但可以节省能源，而且组培苗接受太阳光生长良好，驯化易成活。在阴雨天可用灯光作补充。•主要设备：培养架（控光）、摇床、培养箱（控温控光控湿）、加湿器、空调、紫外光源等。•细胞学实验室：用于培养物的显微观察分析与培养物的记数等。•主要设备：实体显微镜、显微镜、倒置显微镜。•其他小型仪器设备：分注器、血球计数器、移液器、过滤灭菌器、电炉等加热器具、磁力搅拌器、低速台式离心机等。•移栽大棚•基本要求：•A：配置培养架（台），与相关器具，•B：防晒、防雨、防虫，•C：缓冲间，堆料件。第二节植物组织培养的培养条件•一、营养条件—培养基（culturemedium）•在离体培养条件下，不同种植物的组织对培养有不同的要求，甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同。因此，没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官，在建立一项新的培养系统时，首先必须找到一合适的培养基，培养才能成功。培养基种类固体培养基液体培养基▲营养分布均匀，生长整齐一致，但通气性差。通气性较好，便于操作，但营养分布不均，生长发育不整齐。培养基的名称，一直根据沿用的习惯。多数以发明人的名字命名，如White培养基，Murashige和Skoog培养基（MS培养基），也有对某些成分进行改良的改良培养基。常用培养基种类MS培养基B5培养基White培养基N6培养基KM-8P培养基目前国际上流行的培养基有几十种，常用的培养基及特点如下：（1）MS培养基：它是1962年由Murashige和Skoog为烟草细胞而设计的。特点是无机盐和离子浓度较高，为较稳定的平衡溶液。其养分的数量和比例较合适，可满足植物的营养和生理需要。它的硝酸盐含量较其他培养基为高，广泛用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养效果良好。（2）B5培养基：是1968年由Galmborg等为培养大豆而设计的。特点是含有较低的铵，这可能对不少培养物的生长有抑制作用。从实践得知有些植物在B5培养基上生长更适宜，如双子叶植物特别是木本植物。（3）White培养基：是1943年由White为培养番茄根尖而设计的。1963年又作了改良，称作White改良培养基，提高了MgSo4的浓度和增加了硼素。特点是无机盐数量较低，适于生根培养。（4）N6培养基：是1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的。特点是成分较简单，KNO3和（NH4）2SO4的含量高。在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花药培养基和其他组织培养。（5）KM—8P培养基：它是1974年为原生质体培养而设计的。特点是有机成分较复杂，它包含了所有的单糖和维生素，广泛用于原生质体融合的培养。培养基成分水植物激素无机盐有机物培养体支持材料辅助性物质•水（H2O）•配制培养基母液时要用蒸馏水，以保持母液及培养基成分的精确性，防止贮藏过程发霉变质。•大规模生产时可用自来水。但在少量研究上尽量用蒸馏水，以防成分的变化引起不良效果。无机盐•元素名称添加形式•NKNO3,NH4NO3•大量PKH2PO4NaH2PO4•元素KKClKNO3(≥0.5mmol/L)CaCaCl2·2H2O•MgMg2SO4·7H2O•SMg2SO4·7H2O•FeFeNa2-EDTA•微量BH3BO3•元素MnMnSO4(≤0.5mmol/L)CuCuSO4•MoNa2MoO4·2H2O•ClCaCl2·2H2O二、有机物维生素肌醇氨基酸天然复合物椰乳香蕉泥水解酪蛋白碳水化合物马铃薯其它碳水化合物•选用种类：蔗糖（或葡萄糖、果糖）等•蔗糖浓度：2－3%，胚培养为4－15%•高压灭菌部分糖会分解。•大生产时可用绵白糖糖在培养基的作用：1）、为细胞提供合成新物质的碳骨架2）、为细胞的呼吸代谢提供底物和能量3）、维持渗透压种类：VB1、VB6、Vpp、Vc(生物素、叶酸）浓度：0.1－1.0mg/L作用：VB1促愈伤组织产生，提高活力VB6促根生长Vpp与代谢和胚发育有关Vc防组织褐变维生素维生素：硫胺素(VB1)、烟酸（V