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微生物的活化及培养2018年9月10日细菌工业上重要的细菌：G+：枯草芽孢杆菌、乳酸杆菌等;G-：醋酸杆菌、大肠杆菌。产品：淀粉酶制剂，乳酸，乙酸，氨基酸等细菌主要是以二分裂的方式进行增殖（如右图）细菌的繁殖细菌的结构有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。（抗逆性极强）注：不是繁殖体芽孢例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜（如温度、水分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌.放线菌•工业上重要的放线菌:•龟裂链霉菌（土霉素）,金黄色链霉菌（金霉素）,灰色链霉素（链霉素）,红链霉菌（红霉素）,红小单胞菌（庆大霉素）,委内瑞拉链霉菌（氯霉素）,卡那链霉菌（卡那霉素）形状和大小：细胞呈长丝状，菌落呈放线状，介于细菌和真菌之间，菌丝直径0.2～1.2微米，与杆菌接近；生长和繁殖：低等的(如诺卡氏菌)通过菌丝断裂繁殖；高等的(如链霉菌)在孢子丝成熟后分化成许多孢子，孢子在适宜的环境中吸收水分，膨胀、萌发，成为新的放线菌。真菌是通过产生大量的孢子来繁殖后代的，霉菌的直立菌丝顶端生有孢子，蘑菇的菌褶处也生有孢子，孢子随风飘散，在适宜的环境条件下，能发育成一个新个体。单细胞的酵母菌还可进行出芽生殖。孢子生殖和出芽生殖都是无性生殖。真菌多细胞真菌-霉菌单细胞真菌-酵母工业上重要的酵母菌啤酒酵母(酒精、啤酒等),假丝酵母(单细胞蛋白、柠檬酸、脂肪酸、石油脱蜡)第一节微生物活化•一、基本概念•菌种活化就是将保藏状态的菌种转入适宜的培养基中培养，逐级扩大培养得到纯而壮的培养物，即获得活力旺盛的、接种数量足够的培养物。•为什么要进行菌种活化？•菌种保存时的条件往往和培养时的条件不相同，所以要活化，让菌种逐渐适应培养环境，菌种发酵用一般需要2-3代的复壮过程。二、常用的菌种保藏方法1、斜面保藏法方法：接种适宜斜面培养基→培养→4℃保藏措施：低温4℃;适用：各大类保藏期：1~6个月用橡皮塞代替棉塞，可适当延长保藏时间2、石蜡油封藏法方法：斜面或半固体接种→培养→加无菌液蜡高出培养基1cm→4~15℃保藏措施：低温，隔氧适用：不能利用石油的各大类保藏期：1~2年3、砂土管保藏法方法：孢子或芽孢悬液→加入无菌砂土管中→干燥→封口→保藏措施：无营养、缺氧、干燥适用：产孢子（芽孢）微生物保藏期：1~10年4、冷冻干燥保藏方法：菌种培养→用保护剂悬浮→加入安醅管中→低温冻结（-25—-40℃）→抽真空（至0.01mmHg）→真空封口→检查真空度→保藏措施：低温、干燥、缺氧、有保护剂适用：各大类保藏期：5~15年或更长5、甘油悬液低温冷冻保藏法方法：菌种培养→15~30%甘油缓冲液悬浮→加入保藏管中→置-80℃冰箱保藏措施：低温（-80℃）、保护剂（15%~50%甘油）适用：细菌、酵母菌保藏期：约10年6、液氮保藏法方法：菌种培养→保护剂悬浮→加入保藏管中→置液氮瓶中措施：超低温（-196℃）、保护剂适用：各大类保藏期：15年三、菌种活化方法•不同的保藏方式活化的方式也不同：•目前国际国内常用的菌种保存方法包括：定期移植法、液体石蜡法、沙土管法、真空冷冻干燥法、-80℃冰箱冻结法、液氮超低温冻结法。•（1）定期移植法的菌种复苏较简单，直接转接即可。•（2）液体石蜡法保存的菌种在复苏时，挑取少量菌体转接在适宜的新鲜培养基上，生长繁殖后，再重新转接一次。•（3）沙土管法保存菌种在复苏时，在无菌条件下打开沙土管，取部分沙土粒于适宜的斜面培养基上，长出菌落后再转接一次。或取沙土粒于适宜的液体培养基中，增殖培养后再转接斜面。•（4）真空冷冻干燥法保存菌种在复苏时先用75%酒精棉花擦拭安瓿上部，将安瓿管顶部烧热，用无菌棉签沾冷水，在顶部擦一圈，顶部出现裂纹，用挫刀或镊子颈部轻叩一下，敲下已开裂的安瓿管的顶端，用无菌水或培养液溶解菌块，使用无菌吸管移入新鲜培养基上，进行适温培养。•（5）-80℃冰箱冻结法保存菌种复苏时，从冰箱中取出安瓿管或塑料冻存管，应立即放置38℃-40℃水浴中快速复苏并适当快速摇动。直到内部结冰全部溶解为止，约需50秒-100秒。开启安瓿管或塑料冻存管，将内容物移至适宜的培养基上进行培养。•（6）液氮超低温冻结法保存菌种复苏与-80℃冰箱冻结法保存菌种复苏相似，从液氮罐中取出安瓿管或塑料冻存管，应立即放置在38℃-40℃水浴中快速复苏并适当摇动。直到内部结冰全部溶解为止，一般约需50秒-100秒。开启安瓿管或塑料冻存管，将内容物移至适宜的培养基上进行培养。第二节微生物培养培养微生物需要解决的两个问题是什么？1、为其提供合适的营养条件和环境条件2、防止杂菌的入侵培养基、培养条件无菌技术(获得纯净培养物）思考:一、微生物培养基（MEDIUM）•（一）培养基•定义：指人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。•不同微生物、不同的营养要求有不同的培养基•特点：任何培养基都应具备微生物所需要的五大营养要素，且应比例适当，配成后须立即灭菌。五要素：碳源、氮源、生长因子、无机盐和水（二）培养基的配制原则培养基组分应适合微生物的营养特点（目的明确）自养微生物：培养基成分是无机物异养型微生物：培养基成分必须含有机物营养物的浓度与比例应恰当（营养协调）浓度过高——微生物的生长起抑制作用，浓度过小——不能满足微生物生长的需要。物理化学条件适宜（条件适宜）根据培养目的选择原料及其来源（经济节约）•1、明确目的:•首先明确微生物种类，培养自养菌，还是异养菌。•其次明确培养目的，是科研，还是生产。•实验室一般不过多计算成本；生产上使用要考虑是种子培养基还是发酵培养基2、营养要协调:某种物质适合微生物需要，并非浓度越高越好。过低不能满足微生物生长的需要；过多轻则造成浪费，重则抑制微生物生长。微生物对各种营养要素数量的一般要求比例为：水CNPS其它元素生长因子要注意碳氮比（C/N）C/N：培养基中元素碳的量与元素氮的比值，有时也指培养基中还原糖的含量与粗蛋白含量的比值。代谢产物含碳量较高的培养基的C/N比要大于代谢产物含氮量高的培养基。如一般发酵工业中的C/N为100：0.5~2，而Glu发酵培养基的C/N为100：11~21。•3、理化条件要适宜•pH值各大类微生物对pH的要求不同。•原核微生物的pH为中性至微碱性（pH7.0~7.6之间），•真核微生物喜欢偏酸性的环境（pH在4.5~6.5之间）。•同时还要考虑到在代谢过程由于菌体的代谢而引起的pH的变化，通常在培养基中加入一些缓冲剂（K2HPO4、KH2PO4），以维持pH的恒定。•渗透压等渗•氧化还原电位（三）培养基的类型•培养不同营养类型和营养要求的微生物要采用不同的培养基。•（1）按培养基化学组成分•（2）按培养基的物理状态来分•（3）按培养基的功能来分•（4）按培养基的用途分•（5）按所培养微生物类群来分1、按培养基组成成分：•⑴天然培养基•指利用各种动、植物或微生物原料，其成分难以确定。•如肉汤培养基：牛肉膏3g，蛋白胨5g，水1000ml。•常用原料有：牛肉膏、麦芽汁、蛋白胨、酵母膏、麸皮、牛奶、马铃薯、血清等。•天然培养基营养丰富，微生物生长旺盛，来源广泛，配制方便，但稳定性较差。⑵合成培养基是一类化学成分和数量完全知道的培养基，用已知化学成分的化学额药品配制而成。如葡萄糖铵盐培养基：葡萄糖2%，K2HPO40.7%，KH2PO40.3%，MgSO4·7H2O0.01%，（NH4）2SO40.1%，H2O100ml。高氏1号培养基和查氏培养基等这类培养基化学成分精确，重复性强但价格昂贵，微生物生长缓慢，一般只适合做科学研究。⑶半合成培养基指一类主要以化学试剂配制，同时还加有某种或某些天然成分的培养基。例如，马铃薯蔗糖培养基。这种培养基实验室和生产实践中使用最多。2、按培养基的物理状态来分•⑴液体培养基•⑵固体培养基•在培养基中加入凝固剂即为固体培养基。常用凝固剂有琼脂、明胶、硅胶等，以琼脂最为常用，一般用量为1.5%-2%。•⑶半固体培养基•将少量的凝固剂加入液体培养基，即为半固体培养基。琼脂的用量在0.2%-1%之间。主要用于观察微生物的动力，有时用来保藏菌种。固化剂•理想固化剂具备的条件：1）不被微生物液化、分解和利用2）在微生物生长的温度范围内保持固体状态，凝固点温度对微生物无害3）不会因消毒、灭菌而破坏4）配制方便，价格低，透明性好•固化剂：琼脂、明胶、硅胶琼脂（AGAR）主要组成：琼脂糖和琼脂胶两种多糖来源：石花菜等红藻加工特性：绝大多数微生物无法降解琼脂（极少数菌除外）琼脂45℃固化，约100℃才融化灭菌过程中不会被破坏，且价格低廉培养基中的添加量：加0.5%琼脂，可以获得半固体培养基加入1.5%-2.0%琼脂，即成固体培养基加8%琼脂，则成硬固体培养基明胶（GELATIN）•组成：多种氨基酸•来源：动物皮、骨、韧带煮熬•特性：•被许多微生物作为氮源而利用•明胶20℃凝固，28～35℃融化•适用面很窄：只能在20-25℃作凝固剂•但可用于特殊检验硅胶（SILICAGEL）•无机硅酸钠(Na2SiO3)和硅酸钾(K2SiO3)与盐酸和硫酸中和反应时凝结成的胶体•特性：•完全无机•硅胶一旦凝固后，就无法再融化•自养菌的研究分离：培养基的固化剂固体培养基：菌落液体培养基：表面生长均匀混浊生长沉淀生长半固体培养基：无动力有动力(弥散)(是否运动)3、按培养基的功能来分•⑴增殖培养基•在培养基中加入一些某种微生物特别喜欢的营养物质，以增加这种微生物的生长速度，逐渐淘汰其他微生物。•如要分离到利用石蜡油进行发酵的酵母菌，在培养基中加入石蜡油，就可达到目的。•此类培养基常用于菌种筛选。⑵选择培养基•在培养基中加入某种物质以杀死或抑制不需要的菌种的生长。•抗生素—抑制细菌、放线菌；•制霉菌素—抑真菌；•结晶紫、牛胆酸盐—抑G+细菌•链霉素—抑制原核生物的生长，•某种程度上讲，增殖培养基也是一种选择培养基⑶鉴别培养基•在培养基中加入某种试剂或化学药品，使难以区分的微生物经培养后呈现出明显的差别，因而有助于快速鉴别某种微生物。•如用以检查饮用水和乳制品中是否含有肠道致病菌的伊红美蓝（EMB）培养基：蛋白胨10g，乳糖10g，K2HPO42g，2%伊红水溶液20ml，0.325%美蓝水溶液20ml，水1000ml。•大肠杆菌在此培养基上形成较小、带有金属光泽的紫黑色菌落，•产气气杆菌形成较大的呈棕色菌落，肠道致病菌菌落呈乳白色。伊红美兰乳糖培养基(EOSINMETHYLENEBLUE)蛋白胨10g乳糖5gK2HPO42g伊红Y0.4g美兰0.065g水1000mlpH7.2EMB(EOSINMETHYLENEBLUE)Left:Escherichiacolicells.Right:E.colicoloniesonEMBAgar.•有些培养基具有选择和鉴别双重作用。•麦康凯培养基：蛋白胨20g，乳糖10g，牛胆酸盐1.5g，NaCl5g，溴甲酚紫5ml溶液，水1000ml。•胆盐能抑制革兰氏阳性菌（选择性），•乳糖，溴甲酚紫能帮助区别肠道菌和肠道致病菌。4、按培养基的用途分：•⑴种子培养基•营养较为丰富，氮源比例较高•⑵发酵培养基•成分较粗，碳源比例较高，来源较广，成本较低•⑶菌种保藏培养基•...5、按微生物类群来分：细菌培养基——营养肉汤（nutrientbroth)：牛肉膏3g；水1000ml；蛋白胨5g；pH7.2~7.4放线菌培养基——高氏1号：可溶性淀粉20g；KNO31g;K2HPO41gMgSO40.5gNaCl1g;FeSO4•7H2O0.5g水1000ml;pH7.2~7.4霉菌培养基——查氏（zapek)培养基：蔗糖30g;KCl0.5g;MgSO4.H2O0.5g;FeSO40.5g水1000ml;K2HPO41g;NaNO33g;pH6.7酵母菌培养基——麦芽汁培养基zhsun