第3章----植物胚培养

第三章植物胚胎培养•第一节植物胚培养•第二节植物胚乳培养•第三节植物胚珠和子房培养•第四节植物离体授粉第一节植物胚胎培养一、胚培养的概念胚培养(EmbryoCulture)：是将胚从胚珠或种子中取出，置于适宜的培养基生长；包括未成熟胚和成熟胚两种类型的离体培养．胚挽救(EmbryoRescue)：是由于营养或生理原因造成难以播种成苗或在发育早期阶段就败育或退化的胚进行早期离体培养．1、杂种幼胚在人工培养基上培养2、杂种幼胚的胚乳看护培养3、杂种幼胚的愈伤组织培养第一节植物胚胎培养•胚的发育：植物在受精后就开始胚发育。由于胚处在胚囊中，胚囊可以供给胚发育的特殊营养物质。•胚的发育包括原胚时期-球型胚-心型胚-鱼雷胚-成熟胚。胚发育越小，培养时就需要更多更复杂的营养物质。第一节植物胚胎培养体细胞胚胎概念：•体细胞胚（胚状体）：指在组织培养中起源于一个非合子细胞、经过胚胎发生和发育途径（经过原胚、球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚5个时期），形成具有双极性的胚状结构。第一节植物胚胎培养•胚发育可分为异养和自养两个阶段。•异养阶段:在此阶段,胚主要依靠胚乳及周围的母体组织吸取养分.•自养阶段:开始于心形胚后期，此时，胚在代谢上已能由基本的无机盐和糖合成生长所需要的物质.原胚-球型胚-心形胚-鱼雷胚-成熟胚-小苗。种子的结构胚的发育第3章胚胎培养第一节植物胚胎培养二、胚培养的意义用于胚的挽救获得远缘杂种打破种子休眠，缩短育种年限诱导胚状体及胚性愈伤组织种子生活力的快速测定稀有植物的繁殖第一节植物胚胎培养三、胚培养的类型成熟胚培养成熟胚一般指从种子中剥离的发育完全的胚。它培养容易成功,成熟胚材料不受季节性限制。实质是胚的离体萌发过程离休胚培养的发育方式：1.合子胚发育途径；由合子形成球形胚、心形胚、鱼雷形胚、子叶形胚，形成完整的种子，成苗2.“胚”的早熟萌发；幼胚离体培养不是促进胚正常发育成熟形成幼苗，而是以幼小的胚的形态早熟萌发形成畸形苗。苗的根、茎、叶俱全，但子叶中几乎无营养积累而极端瘦弱，在培养中适当调整培养基配方可以防止早熟萌发3.脱分化形成愈伤组织。幼小的胚在离体培养时多数情况下脱分化形成愈伤组织。主要原因为培养基中成分不适宜第一节植物胚胎培养•成熟胚•未成熟胚维持胚的生长，进行正常的胚胎发育成熟，完成胚胎发育的全过程。正常发育形成小苗按正常胚胎发育途径形成植株第一节植物胚胎培养小植株愈伤组织激素浓度高胚状体或不定芽分化培养基愈伤组织途径离体胚PAG6,PAG27可以促进体细胞胚的形成第一节植物胚胎培养胚“早熟萌发”离体的幼胚在培养基上不能长出成熟胚的各种结构，越过正常胚胎发生过程中的若干阶段，直接长成弱小的幼苗，只具有离体时已有的结构。第一节植物胚胎培养四、成熟胚的培养1、材料的消毒与接种2、培养基大量元素和微量的无机盐为基本成分谷氨酰胺作为氮源，可以促进胚生长植物天然浸提物（YE）促进胚生长硫氨素促进胚根的伸长生长素低浓度促进胚的发育（胚根）赤霉素促进有后熟作用的种子萌发3、培养条件pH一般为5.2-6.3、加热灭菌后PH通常会下降12小时光照和25C，热带兰花杂交种胚30C附加成分第一节植物胚胎培养五、幼胚培养方法•（一）材料的选择与灭菌•（二）幼胚的分离及培养第一节植物胚胎培养•（一）材料的选择与灭菌•取材时期：大多数幼胚成功的实例证明，适宜于幼胚发育时期多为心形胚至鱼雷形胚。（在解剖镜下观察，摸索植物的授粉天数与胚胎发育的对应关系）。•操作：取回大田或温室里授粉受精后的植物子房，用70%的酒精进行表面消毒，再用0.1%氯化汞灭菌10-30min，用无菌水冲洗3-4次，即可用于胚的分离和培养。•次氯酸钠：5%的次氯酸钠处理10min用无菌水冲洗3-4次，即可用于胚的分离和培养。第一节植物胚胎培养•胚龄和胚的发育形态一般认为胚龄是影响胚培养成功的关键因素之一。1、球型胚:成苗少,苗发育不良,缺叶绿素,子叶不发生。2、心型胚:叶小白色,真叶发生需3-4周,后面的生长也不良。3、鱼雷胚:叶绿色,展开的子叶大,苗发育较前两时期好。第一节植物胚胎培养•（二）幼胚的分离及培养•幼胚剥离：幼胚剥离是关键的关键，幼胚是一种半透明、高粘稠状组织，剥离过程极易失水干缩，因此操作速度要迅速。胚柄参与幼胚的发育，取材时应带胚柄。•接种培养：了解培养对象的特性，比如休眠、春化作用、胚萌发温度等。第一节植物胚胎培养•葡萄胚挽救的几个步骤图例：•a.取材料第一节植物胚胎培养材料处理，灭菌剥胚第一节植物胚胎培养取胚第一节植物胚胎培养胚发育阶段第一节植物胚胎培养正常成苗第一节植物胚胎培养培养室炼苗第一节植物胚胎培养温室炼苗第一节植物胚胎培养移栽大田，生长为壮苗第一节植物胚胎培养幼胚培养的关键技术：取材时期幼胚剥离培养基设计培养条件的控制（是否需要特殊处理）第一节植物胚胎培养六、幼胚培养条件培养基环境条件植物材料：胚柄第一节植物胚胎培养1.培养基•基本培养基：MSN6White等•糖的作用：蔗糖是最好的碳源之一，主要调解渗透压的作用•无机氮以硝酸盐、铵盐的形式存在可以提高钾和钙的浓度•氨基酸：谷氨酰胺刺激胚的生长；水解蛋白•维生素：促进幼胚的早期发育•植物生长调节剂•天然有机物：胚乳看护培养第一节植物胚胎培养胚乳看护培养•大麦离体胚，在含有同种胚乳的培养基中，对胚的生长促进。•大麦离体胚，在含有异种胚乳的培养基中，对胚的生长促进作用更强。•大麦×黑麦杂交胚，在含有大麦胚乳的培养基中，成苗率提高30-40%。第一节植物胚胎培养2.环境条件•温度：胚培养25-30℃•光照：黑暗或弱光，光对胚胎发育有轻微抑制作用第一节植物胚胎培养3.胚柄•胚柄是一个短命结构，球形胚时期，胚柄发育成最大。•胚柄参与幼胚的发育•5mg/L赤霉素能有效的取代胚柄的作用第二节植物胚乳培养•植物胚乳培养•含义：将胚乳组织从母体上分离出来，通过离体培养，使其发育成完整植株的技术。•被子植物的胚乳是三倍体由两个中央极核与一个精核结合而成；裸子植物的胚乳是单倍体（由大孢子发育而来）。胚乳的产生第二节植物胚乳培养胚乳培养的探讨胚乳培养的最早研究始于1933年，Lampe和Mills首例进行了玉米胚乳培养。胚乳细胞的全能性。大多数被子植物的胚乳是三倍体，能否通过胚乳培养获得三倍体植株而得到无籽果实；通过胚乳培养技术，探索改良农、林及园艺植物三倍体育种技术的可能性。研究离体培养条件下胚和胚乳的关系。胚乳细胞是研究淀粉、蛋白质和脂类天然产物代谢途径的理想系统。第二节植物胚乳培养目前研究概况•12科，40多种。•蔷薇科：苹果，梨，桃。•禾本科：大麦、玉米和水稻。•茄科：枸杞、马铃薯。第二节植物胚乳培养一、胚乳培养方法1、胚乳外植体的选择制备。游离核型期材料难以培养，而细胞型期的材料易于成功。从盛花期后胚乳组织进入细胞型期的是时间玉米为8-12天，小麦为8天，黄瓜为7-16天2、胚乳愈伤组织的诱导及器官分化：（1）器官发生途径，先生成芽后生成根。（2）胚胎发生途径，在愈伤组织上直接生成胚状体，后生成小苗。造成染色体倍性变化的主要原因有：培养基中的外源激素。猕猴桃的确胚乳培养中，当培养基中含有3.0mg/LZt+0.5-1.0mg/L2,4-D时产生的植株多是三倍体，而在3.0mg/LZt+0.5-1.0mg/LNAA时产生的植株多数不是三倍体。继代的次数越多，倍性越不稳定。第二节植物胚乳培养（一）胚乳外植体的制备•有较大的胚乳的种子，消毒剥去种皮，培养•胚乳外有粘性物质包裹的，消毒、去皮、去粘液，取出胚乳组织培养•有果实的种子，将果实消毒，切开幼果，取出种子，分离出胚乳组织进行培养第二节植物胚乳培养（二）胚乳愈伤组织的建立•1.愈伤组织诱导胚乳接种到培养基上6-7d，细胞分裂，形成原始细胞团，即为愈伤组织。•2.形态建成•器官发生：巴豆(先根)、麻风树（先芽）最后在分化培养基上没能发育成小植株。要分化必须选择特定的激素和附加物。例如（枸杞：BA、BA+NAA分化77-85%：猕猴桃：ZT）•体胚发生：柑橘、桃、枣第二节植物胚乳培养（三）三倍体后代特征•1.形态特征被子植物通过胚乳培养得到三倍体植株，产生无籽果实。•2.胚乳再生植株的倍性染色体常常发生变化；同一植株往往是不同倍性的嵌合体；倍性混乱在胚乳培养中相当普遍•3.影响倍性因素：胚乳类型、胚乳愈伤组织发生部位、培养基外源激素第二节植物胚乳培养二、影响胚乳培养的因素•1.植物外植体胚乳发生类型和发育程度胚在胚乳培养中的作用•2.培养基与激素•3.培养条件第二节植物胚乳培养•时间:早于胚的发育，一般不经过休眠。•类型:核型胚乳、细胞型胚乳、沼生目型胚乳1、核型胚乳:普遍的形式，先期核多次分裂（胚乳核），但不形成细胞壁，称为游离核形成期。发育后期产生细胞壁，形成胚乳细胞。单子叶植物、双子叶植物的离瓣花(schizopetalousflower)为核型胚乳。胚乳的发育类型第二节植物胚乳培养2、细胞型胚乳：无游离状态，核的分裂伴随壁的形成。双子叶的合瓣花（烟草、番茄）3、沼生目型胚乳：第一次分裂形成2个细胞（即珠孔室、合点室），但接着进行多次游离核分裂，在发育后期只有珠孔室能形成细胞壁。第二节植物胚乳培养胚乳发育时期的影响：1.发育早期的胚乳，接种不方便，愈伤组织的诱导频率很低。2.处于旺盛生长期的胚乳，离体条件下最易诱导产生愈伤组织，诱导率最高，可达90-95%。3.接近成熟或完全成熟的胚乳，愈伤组织诱导频率很低。第二节植物胚乳培养胚乳发育时期•例如：•玉米在授粉后8-12d的胚乳适合离体培养。•水稻在授粉后4-7d的胚乳适合离体培养。•小麦在授粉后8-12d的胚乳适合离体培养。•大麦在授粉后10-20d的胚乳适合离体培养。第二节植物胚乳培养胚在胚乳培养中的作用•胚乳培养中两种方式：带胚培养和不带胚培养带胚培养（早期胚乳）更容易形成愈伤组织处于生长旺盛期的不需要，生理活性微弱的胚乳(完全成熟的胚乳）必须借助于胚的增殖作用•赤霉素可替代胚的作用第二节植物胚乳培养培养基与培养条件•培养基：MS、水解酪蛋白、酵母提取物、蔗糖、外源激素、pH•温度：25℃•光照：因物种而异第三节植物胚珠和子房培养胚珠的结构胚囊内珠被外珠被珠柄第三节植物胚珠和子房培养一、胚珠培养•含义：将胚珠从母体上分离出来，在人工控制下，进行离体培养，使其生长发育形成幼苗的技术。•类型：受精胚珠培养、未受精胚珠培养倒生胚珠第三节植物胚珠和子房培养•（一）胚珠培养方法•1.材料的选择和灭菌•培养受精胚珠：从大田或温室取回授粉时间合适的子房；•培养未受精胚珠：取授粉前时间合适的子房；•消毒后，用解剖刀沿子房纵轴切开，取出一个个胚珠（可带胎座），接种。•2.培养基对胚珠培养的影响•3.胎座和子房对胚珠培养的影响•4.胚发育时期的影响第三节植物胚珠和子房培养•(二)培养基对胚珠培养的影响•椰子汁、酵母提取物、•水解酪蛋白、氨基酸、蔗糖等矮牵牛胚珠培养：授粉后7d，胚珠处于球形胚期，剥离后放在蔗糖浓度4%-10%的培养基上，可发育成成熟的种子。第三节植物胚珠和子房培养•（三）胎座和子房对胚珠培养的影响•胎座和子房的某些组织在胚珠发育初期起着重要作用•（四）胚发育时期的影响•球形胚时期〉合子和原胚时期第三节植物胚珠和子房培养二、子房培养•含义：将子房从母体上分离下来，置于培养基上，使其发育成幼苗的技术。•子房：由子房壁、胎座、胚珠组成胚珠和子房培养雌蕊与子房的类型第三节植物胚珠和子房培养培养方法•外植体的制备与胚珠培养方法相似•培养基椰子汁、酵母提取物（YE）、B族维生素IAA第四节植物离体授粉一、含义：在人工控制下将未授粉的胚珠或子房从母体上分离下来，进行无菌培养，并以一定的方式授以无菌花粉，使之在试管内实现受精的技术，也称试管受精，离体受精。•方法：•离体柱头授粉•离体子房授粉•离体胚珠授粉第四节植物离体授粉离体授粉的三种方式第四节植物离体授粉二离体授粉的方法•.实验材料的选择•选用子房大有多个胚珠的植物，如茄科、玉米•多保留母体花器官组织有利于离体授粉