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1、打开后的界面如图。2、点FILE---NEW—DNASEQUENCE如图3、输入目的基因片段，可以复制后用ctrl+V键拷贝到栏内，后应加数个N以备后续设计时加酶切位点及保护碱基，如图所示。输入目的基因片段，可以复制后用ctrl+V键拷贝到栏内，后应加数个N以备后续设计时加酶切位点及保护碱基，如图所示。4、此主题相关图片如下：选中enzyme图标，将所选质粒上的多克隆酶切位点加入左栏此主题相关图片如下：选中OK键，5、分析目的基因中所含的酶切位点，选插入位点时就应排除这些酶此主题相关图片如下：6、选中primer图标，点S图标，editprimer,开始设计正义链。此主题相关图片如下：7、软件默认引物为二五个碱基此主题相关图片如下8、可将鼠标点在设计框的3端从右向左删除7－9个碱基，保留16－18个配对即可此主题相关图片如下：9、在引物的5端加入选好的酶切位点并在其左侧加3个保护碱基，入该图加入HINDIII酶切位点及TTA保护碱基，完成后点analyze，认为可以后点OK。此主题相关图片如下：10、选中左上角A图标，用鼠标拉动滑块将待选引物放至目的基因末端。11、从3端删除7－9个碱基同正义链。此主题相关图片如下：12、将酶切位点加在5端，应将产品目录所示的酶切位点序列从右至左加入（注意不要加反）如图加入BamHI酶切位点及CGC3个保护碱基。完成后点analyze，认为可以后点OK。此主题相关图片如下：13、最后分析结果如图，反义链的FALSEPRIMING可以不考虑，RATING表示引物评分也可以不考虑，主要看Tm值正义链和反义链相差不应超过3度。GC含量不应超过60％此主题相关图片如下：14、该软件有个缺点，不能保存分析结果，只能选择打印此主题相关图片如下：15、如果设计RT-PCR检测的引物就如下所示，同上输入目的基因片段，选SEARCH图标，选择参数，一般选PCRprimers---both—100至250个碱基，引物长短20＋/-2，searchparametere中的参数可以不选，为默认设置。点OK。此主题相关图片如下：16、显示满足设计参数的候选结果，点OK.此主题相关图片如下：17、点SENES选择正义链，RATING表示引物评分，最好选评分高的。此主题相关图片如下：18、点ANTI-SENSE,相同方式选择反义链。整个一队引物评价同目的基因克隆的引物设计相同此主题相关图片如下：