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1基因工程原理复习题思考题考试时间：2009.06.21上午9：00-11：00地点5D305基因工程绪论1、基因工程的定义与特征。定义：在体外把核酸分子（DNA的分离、合成）插入载体分子，构成遗传物质的新组合（重组DNA），引入原先没有这类分子的受体细胞内，稳定地复制表达繁殖，培育符合人们需要的新品种（品系），生产人类急需的药品、食品、工业品等。特征：1、具跨越天然物种屏障的能力。2、强调了确定的DNA片段在新寄主细胞中的扩增。2、试述基因工程的主要研究内容。1）、目的基因的分离2）、DNA的体外重组（载体、受体系统等）3）、重组DNA分子转移到受体细胞及其筛选4）、基因在受体细胞内的扩增、表达、检测及其分析。3、基因工程在食品工业上有何应用发展？主要是通过基因重组，使各种转基因生物提高生产谷氨酸、调味剂、酒类和油类等有机物的产率；或者改良这些有机物组成成分，提高利用价值。4、转基因是一把双刃剑，请客观谈谈对转基因及转基因食品安全性的认识。转基因技术所带来的好处是显而易见的，在人类历史进步和发展中起到了积极作用。首先，通过该项技术可以提供人们所需要的特性，改良培育新品种；第二，延长食品保存时间或增加营养成分；第三，将抗虫防菌基因转入到作物中，使作物本身产生抵抗病虫害侵袭的能力，减少了农药的使用量，有利于环境保护；第四，转基因技术及基因食物在医学方面得到广泛研究和应用。人们对转基因技术的主要担忧在于环境方面。外源基因的导入可能会造就某种强势生物，产生新物种或超级杂草、损害非目标生物、破坏原有生物种群的动态平衡和生物多样性，也即转基因生物存在潜在的环境安全问题。转基因作物的大面积种植已有数年，食用转基因食品的人群至少有10亿之多，但至今仍未有转基因食品对生命造成危害的实例；更何况目前每一种基因工程食品在上市前，都要经过国家法律认可，食品卫生部门和环境部门的严格检测。只有测试合格了，才能投放市场。因此公众完全可以安全地消费、大胆地食用转基因食品。第一章DNA的分子特性与利用1、原核生物和真核生物的基因表达调控有何差别？1）原核基因表达调控的三个水平：转录水平调控、翻译水平调控、蛋白质加工水平的调控原核基因表达调控主要是在转录水平上的调控。2）真核生物基因表达的特点：1．基因组DNA存在的形式与原核生物不同；2．真核生物中转录和翻译分开进行；3．基因表达具有细胞特异性或组织特异性；4．真核基因表达的调控在多个水平上进行：DNA水平的调控、转录水平调控、转录后水平调控、翻译水平调控、蛋白质加工水平的调控；22、什么是基因？根据基因的产物，基因可分为哪三类？基因是具有生物学功能的、在染色体上占据一定位置的一段核苷酸序列，是分子遗传的功能单位。根据基因的产物，基因可分为三类：转录并翻译编码蛋白质的基因:包括结构蛋白基因、编码酶的基因、调节基因转录但不翻译产物的基因:包括tRNA、rRNA不转录但有功能的DNA区段:如启动子、操纵基因3、引起核酸变性的因素主要有哪些？核酸变性后性质有何变化？引起核酸变性的因素：--温度、酸、碱、甲醛和尿素等。DNA变性后，它的一系列性质发生变化，如紫外吸收(260nm)值升高（增色效应）,粘度降低等，如DNA增加25－40%.RNA约增加1.1%。。4、DNA复性及其影响因素。变性DNA在适当的条件下，两条彼此分开的单链可以重新缔合成为双螺旋结构，这一过程称为复性。DNA复性的程度、速率与复性过程的条件有关，也与它本身的组成和结构有关：分子量越大复性越难。浓度越大，复性越容易。（附加：注意：将热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不可能复性。但是将变性的DNA缓慢冷却时，可以复性。复性的应用：核酸的杂交，分子扩增）第二章基因工程操作的基本技术1.DNA凝胶电泳中核酸分子分离的机理。在碱性环境下，核酸分子带负电荷，在外加电场的作用下，分子在凝胶多孔性刚性滤孔中从负极向正极泳动，其中主要由于分子筛效应和电荷效应达到分离不同大小核酸分子的目的。2.DNA凝胶电泳中影响电泳迁移率的因素主要有哪些？1）分子本身的影响分子的大小：小则快带电荷数：多则快分子构型：超螺旋解螺旋2）电场：直流电场电压高则快电压太高则结果不准确常用3~5V/CM3）支持物介质种类：琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶凝胶浓度:浓度大，筛孔小，适合小分子电泳；浓度小，筛孔大，适合大分子电泳4）电泳缓冲液pH值：偏碱性，带负电荷离子浓度：离子浓度高电流大发热快胶溶解种类：TAE、TBE、TPE、TNE33.PCR的原理和主要反应过程，并分析影响PCR扩增的影响因素。PCR原理：变性温度下，DNA双链变性双螺旋解开成单链DNA，在退火温度中人工合成的特异引物根据碱基互补配对原则与单链DNA特异结合，然后在DNA聚合酶的作用下，在延伸温度下不同的脱氧核苷酸按照碱基互补配对原则在引物的引导下合成与模板DNA互补的新链，实现DNA的扩增。影响PCR扩增的影响因素：§(1)Taq酶：常用1U/25µL浓度低，扩增产物不够；浓度高，非特异性扩增增加；酶的活性；§(2)dNTP的浓度：常用100-200µmol/L，不能低于20µmol/L，特异性、保真性；§(3)模板：主要考虑纯度及使用量，对纯度要求不高，但含有酚、氯仿等杂质则难以成功。使用量从几个ng到100ng.§(4)引物浓度：0.1-0.5µmol/L之间，过多则非特异扩增增加，形成引物二聚体；§(5)Mg2+浓度：常用0.5-2.5mmol/L；影响：酶的活性、引物-模板退火、特异性§(6)PCR反应程序设定：变性温度和时间、引物退火温度Tm与时间、引物延伸温度与时间和循环数4.PCR引物设计的原则，若给一指定DNA序列并需要通过PCR扩增此序列，如何设计扩增引物？（关于如何设计这个问题，靠自己了）引物设计原则：1、G+C含量45-55%；2、Tm值高于55；3、引物特异性；4、引物扩增跨度；5、是否形成引物二聚体5.定量PCR的原理？Ct值的含义。原理：通过实时检测PCR每一个循环扩增产物相对应的荧光信号，来实现对起始模板进行定量及定性的分析。初始模板量X0的对数值与C(T)值之间呈线性关系：logX0=-log(1+Ex)*Ct+logNCt值的含义是：每个反应管内的荧光信号开始由本底进入指数增长阶段时到达设定的域值时所经历的循环数（如后图所示，图仅供参考）ThresholdlineC(t)valueC(t)value18.12+/-0.04阈值线Ct值Ct值46.分子杂交的类型主要有哪些？探针的标记方法与标记类型？常用的双链DNA的标记方法是哪两种？探针的标记方法：切口平移法、随机引物合成法，末端标记法，PCR标记法，体外转录标记法。探针按核酸分子分：DNA探针和RNA探针；按标记物的不同：放射性标记探针和非放射性标记探针。标记类型：按核酸分子的不同：可分为DNA探针和RNA探针根据标记物的不同：可分放射性标记探针和非放射性标记探针；双链DNA探针标记主要方法：切口平移法、随机引物合成法；7.Southern杂交一般过程及影响杂交因素。Southern杂交操作步骤:(1)用限制性内切酶酶切DNA,经凝胶电泳分离各酶切片段；(2)转膜：将DNA片段转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上；(3)预杂交：封阻滤膜上非特异性位点；(4)杂交：让探针与同源DNA片段特异性结合；(5)洗脱：去除非特异性结合的探针；(6)自显影检查目的DNA所在的位置。Southern杂交影响因子1）、目的DNA在总DNA中所占的比例2）、探针的大小和标记效率3）、转移到滤膜上的DNA量4）、探针与靶DNA的同源性8.基因组文库的构建过程？如何确定文库的大小？基因组文库的构建过程：1）从生物体提取大片断的基因组DNA；2）用适当的限制性内切酶（常为4碱基识别位点）进行部分酶切或超声波打断基因组DNA；3）在琼脂凝胶电泳上或蔗糖梯度离心筛选适当长度的DNA片断（根据载体的要求）；4）载体的酶切、回收；5）将处理好的基因组DNA片断与载体连接；6）将重组子导入宿主细胞7）文库的鉴定、收集、保存；5确定文库大小的方法：以在构建的基因组文库中任一基因存在的概率来衡量文库的质量或完备性，它与基因文库最低所含克隆数N（即文库大小）之间的关系可用下式表示：N=ln(1–P)/ln(1–f)其中：N：文库所需的总克隆数；P：任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率；f：克隆片段的平均大小/生物基因组的大小。9.基因文库的类型包括哪两种？各有什么特点？10.一般质粒DNA的构型有哪几种？在琼脂糖凝胶电泳中的有何特点？超螺旋质粒DNA、开环质粒DNA、线状质粒DNA在琼脂糖凝胶电泳的特点是：电泳的泳动速度由大到小分别是：超螺旋质粒DNA线状质粒DNA开环质粒DNA11.碱裂解法提取质粒DNA的原理，分析影响试验结果的各种可能因素。碱裂解法原理：在碱性条件下，双连DNA氢键断裂，结构破坏变性，环状超螺旋质粒不充分变性。在中性条件下变性质粒恢复原来构型，而线性大分子细菌DNA不能复性呈不溶物而经离心除去。（各种可能因素是上一届的，具体其实大家可以根据那天师兄说的去写）提取失败：1）洗去双链时，将质粒DNA洗去；2）破壁失败，质粒没析出；3）加剂问题电泳失败：1）电压太高2）没加染色剂3）胶穿孔4）电泳时间过长12.电泳缓冲液使用一定时间后出现DNA在凝胶中跑不动现象的原因，有何解决办法？原因：电泳缓冲液的离子的富集作用；解决方法：1.更换成新配置的电泳缓冲液；2.把电泳槽中的缓冲液倒出混匀后再重新使用13.电泳的指示剂和染色剂有何区别，各自的作用是什么？指示剂一定要在电泳前加入，指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液；（一般为：溴酚兰，二甲苯青）作用：①预知电泳的速率及方向；②使样品呈现颜色，便于加样；③一些高浓度蔗糖或其它物质增加DNA的密度，可以防止DNA的扩散染色剂即可以在电泳前加入样液，又可以电泳后再对凝胶染色；（溴化已锭[EB]、硝酸银、Goldview染料）作用：呈现出核酸电泳后的带型。6第三章基因克隆的酶学基础1、限制性核酸内切酶的类型，基因工程常用的是哪种限制性核酸内切酶？（常用II型）2、什么是星活性，产生星活性的因素可能有哪些？在非最适合的条件下酶的识别特异性降低，产生非特异性带，这种活性称星活性。产生Star活性的因素：（书上P46-P47答案）高浓度甘油，碱性pH，存在Mn2+，低离子强度，低盐浓度，低pH3、结合已做的实验，分析影响酶切的因素。（这个答案是上届的，仅供参考）1）DNA的纯度：DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。2）DNA的甲基化程度：dam甲基化酶（修饰GATC中的A）；dcm甲基化酶（修饰CCA/TGG的C）。3）温度：不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37oC，少数要求40-65oC。4）缓冲液(Buffer)：是影响限制酶活性的重要因素。MgCl2、NaCl/KCl：提供Mg2+和离子强度；Tris-HCl：维持pH；二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性；牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定；β－巯基乙醇：保持酶的稳定性，防止酶失活4、限制性核酸内切酶命名规则及各字母代表的含义。（例子和图帮助大家理解而已）命名规则：寄主菌属名的第1个字母＋种名的前两个字母＋菌株或菌型代号（大写）＋空白＋发现序列（罗马数字）例子：EcoRⅠ(E：属名；co：种名；R：株；Ⅰ：发现次序)75、简单叙述同尾酶和同裂酶的差别。同尾酶：来源不同，识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端，连接后不能被相关的酶同时切割。同裂酶：识别序列相同，切割位点有些相同，有些不同。分完全同裂酶和不完全同裂酶（PS：完全同裂酶：识别位点和切点完全相同。不完全同裂酶：识别位点相同，但切点不同。）6、连接酶主要有哪些类型？有何异同点？影响连接酶连接效果的因素主要有哪些？类型：DNA连接酶和RNA连接酶异同点：相同点：都能以DNA为模