DNA的粗提取和鉴定

高中生物复习课件卉原中学王廷杰选修三现代生物科技专题致同学们专题一基因工程专题二细胞工程专题三胚胎工程专题四生物技术的安全性和伦理问题专题五生态工程第三讲DNA的粗提取和鉴定【考纲解读】考点考纲要求DNA的粗提取与鉴定（1）理解实验目的、原理、方法和操作步骤，掌握相关的操作技能，并能将这些实验涉及的方法和技能进行综合运用。（2）具备验证简单生物学事实的能力，并能对实验现象和结果进行解释、分析和处理。（3）具有对一些生物学问题进行初步探究的能力，包括运用观察、实验与调查、假说演绎、建立模型与系统分析等科学研究方法。（4）能对一些简单的实验方案做出恰当的评价和修订。研究课题DNA的粗提取和鉴定2、如何证明DNA是遗传物质？3、DNA主要存在部位是哪里？1、生物的遗传物质是什么？用一定的物理或化学方法分离具有不同物理、化学性质的生物大分子（蛋白质、核酸等）。4、提取DNA时，主要的杂质是什么？如何除去？RNA、蛋白质、脂质等。利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。一、基础知识——实验原理1、DNA的溶解性：利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反。如何利用DNA的溶解性使DNA与其他杂质分离？（2）在酒精溶液中的溶解性：DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步分离。（1）在NaCl溶液中的溶解性：根据原理找方法2、DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性①蛋白酶对DNA没有影响。②DNA能耐80℃高温。③洗涤剂对DNA没有影响。如何利用DNA对酶、高温、和洗涤剂的耐受性，使DNA与其他杂质分离？根据原理找方法——二苯胺试剂鉴定在沸水浴条件下、DNA与二苯胺反应呈现蓝色。3、DNA的鉴定二、实验方案设计（一）实验材料：（二）方法步骤：1、获取含DNA的滤液：2、去除滤液中的杂质：3、DNA的析出：4、DNA的鉴定：（三）结果分析与评价：（一）实验材料：2、常用材料：动物：鸡血；植物：菜花。1、选材原则：凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但选用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。（从中选取2～3种实验材料并比较实验结果）鱼卵、猪肝、菜花、香蕉、鸡血、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、在液体培养基中培养的大肠杆菌。（二）方法步骤：1、破碎细胞，获取含DNA的滤液：（1）动物细胞：破碎较易。例如，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可。蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA。（2）植物细胞：先用一定的洗涤剂和食盐溶解细胞膜;再充分研磨。洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解。例：提取洋葱DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行从分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。答：会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物;用二苯胺鉴定不显示蓝色等。讨论：如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？2、去除滤液中的杂质：讨论：此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质。方案一讨论：为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离。3、DNA的析出：DNA的析出用的是与滤液体积相等的冷却的酒精溶液（体积分数为95％），静置2－3min，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水。在试管中先加入物质的量的浓度为2mol/L的NaCl溶液5ml于两只试管中，其中一只加入DNA丝状物，各加入4ml二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，待试管冷却后，比较两只试管中溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否有蓝色。4、DNA的鉴定：方案实例一：以鸡血为实验材料进行DNA的粗提取②鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求较高，操作繁琐，历时较长。1、实验材料：①鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得。①DNA在NaCl溶液中的溶解度，随着NaCl的浓度的变化而改变。当NaCl浓度为0.14mol／L时,DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。②DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。③DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。2、实验原理：3、材料用具：鸡血细胞液（5-10ml）；蒸馏水；二苯胺试剂。95%的冷酒精溶液（置于冰箱内冷却24h）；0.1g/ml的柠檬酸纳溶液；2mol/L和0．015mol/L的NaCl溶液；铁架台；铁环；镊子；三角架；酒精灯；石棉网；载玻片；玻璃棒；滤纸；滴管；量筒；烧杯；试管；漏斗；试管夹；纱布。鸡血细胞液的制备：取质量浓度为0．1g/ml的柠檬酸纳溶液100ml，置于500ml烧杯中。注入新鲜的鸡血（约180ml），同时用玻璃棒搅拌，使血液与柠檬酸纳溶液充分混合，以免凝血。将烧杯中的血液置于冰箱内，精置一天，使血细胞自行沉淀。（也可以将血液倒入离心管内，用1000r/min的离心机离心2min，血细胞沉淀于离心管底部。实验时。用吸管除去离心管上部的清液，就可以得到鸡血细胞液。）鸡血细胞破碎以后释放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，所以在提取过程中为了减少DNA的损失，最好使用塑料的烧杯和试管盛放鸡血细胞液。注意事项:4、方法步骤：向鸡血细胞液中加入蒸馏水，同时用玻璃棒充分搅拌5min，使血细胞加速破裂。然后过滤，取其滤液。（1）提取鸡血细胞的细胞核物质让细胞内浓度大于周围溶液的浓度，细胞会吸水以至胀破。加入蒸馏水后细胞会有什么变化？用玻璃棒搅拌有什么意义？用玻璃棒搅拌可以加速血细胞和细胞核的破裂。注意应沿一个方向快速搅拌，但也不能太快太猛，防止打碎DNA。滤去的是什么物质？得到的是什么？过滤将滤去的是细胞膜和核膜等物质；得到的是与蛋白质等物质结合在一起的DNA。4、方法步骤：（2）溶解细胞核内的DNA将2mol的氯化钠溶液40mL加入到滤液中，并用玻璃棒沿一个方向搅拌1min，使其混合均匀，这时DNA在溶液中呈溶解状态。沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水，同时用玻璃棒不停地轻轻搅拌，这时烧杯中有丝状物出现，注意观察丝状物呈什么颜色。继续加入蒸馏水，溶液中出现的粘稠物会越来越多。当粘稠物不再增加时停止加入蒸馏水（这时溶液中氯化钠的物质的量浓度相当于0.14mol／L）。（3）析出含DNA的粘稠物注意事项：将溶液中的DNA与其他杂质分离，这一步骤是实验成败的关键。实验中应该缓慢贴壁加入蒸馏水，并轻轻地沿一个方向不停地均匀搅拌，以利于DNA分子的附着和缠绕。4、方法步骤：（4）滤取含DNA的粘稠物用放有多层纱布的漏斗，过滤步骤3中的溶液至500mL的烧杯中，含DNA的粘稠物被留在纱布上向50mL烧杯内注入2mol／L的氯化钠溶液20mL。用钝头镊子将纱布上的粘稠物夹至氯化钠溶液中，用玻璃择不停地搅拌，使粘稠物尽可能多地溶解于溶液中。（5）将DNA的粘稠物再溶解用放有两层纱布的漏斗过滤步骤5中的溶液。取其滤液，DNA溶于滤液中。（6）过滤含有DNA的NaCl溶液（7）提取含杂质较少的DNA在上述滤液中加入95％的冷酒精溶液50mL（使用冷酒精对DNA的凝集效果较佳），并用玻璃棒搅拌，溶液中会出现含杂质较少的丝状物。用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。这种丝状物的主要成分就是DNADNA分子直径只有2nm，看到的丝状物是多个DNA子聚在一起形成的。4、方法步骤：（8）DNA的鉴定取两支20mL的试管，各加入氯化钠的物质的量浓度为0.015mol／L的溶液5mL，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4ml／L的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，待试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化。案例一：DNA的粗提取和鉴定实验实验原理：目的要求：材料用具：（1）DNA在NaCl溶液中的溶解度，随着NaCl溶液浓度的变化而改变。①提取核物质方法步骤：（2）DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些物质可溶于酒精。（3）DNA+二苯胺————→蓝色物质②溶解核内DNA③析出DNA④滤取含杂质的DNA⑤粗DNA再溶解⑥滤出DNA⑦提取较纯DNA⑧DNA的鉴定NaCl溶液浓度DNA溶解度“两次蒸馏水，三次过滤，两次析出，六次搅拌”讨论：此实验过程中有几次使用蒸馏水？几次过滤，几次析出，几次搅拌？分别在哪一步？（1）两次蒸馏水：①第一步细胞吸水胀破。②第三步使DNA黏稠物析出。（2）三次过滤：①第一步DNA存在于滤液里。②第四步DNA被留在纱布上。③第六步DNA存在于滤液里。（3）两次析出：①第三步用0.14mol／L的NaCl溶液含杂质多。②第七步用95%的冷酒精。过滤时用纱布层数与需用滤液或黏稠物有关，第二次要用其滤出的黏稠物，用多层纱布，第一次和第三次均要用其滤液，用纱布1－2层。（4）六次搅拌：第一、二、三、五、七步。其中除第八步外，其余均要朝一个方向搅拌，在第三、五步搅动还要轻缓，玻璃棒不要直插烧杯底部，这样才能保证得到完整的DNA。蓝色沸水浴实验步骤流程图鲜鸡血0.1g/mL柠檬酸钠搅拌、离心或低温静置①20mL蒸馏水搅拌、过滤②2mol/LNaCl、搅拌③蒸馏水搅拌④过滤含DNA的粘稠物⑤2mol/LNaCl、搅拌⑥过滤滤液（含DNA）⑦冷酒精搅拌DNA⑧二苯胺试剂滤液（弃）不溶物（弃）上层清液（弃）鸡血细胞液不溶物（弃）DNA滤液（含DNA）（二）案例二：以菜花为实验材料进行DNA的粗提取1、课前准备将新鲜菜花和体积分数为95％的乙醇溶液放入冰箱冷冻室24h2、提取DNA的具体步骤①取材：称取30g菜花，去梗取花，切碎②研磨：将碎菜花放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨10min研磨液的配制方法如下：将10.1gTris加入到50mL蒸馏水中，使其溶解，然后，用2moL/L的HCl溶液调节pH至8.0，再加入8.76gNaCl、37.2gEDTA、20gSDS。待上述药品全部溶解后，再用蒸馏水定容至1000mLTris/HCl:提供缓冲体系，DNA在这一体系中呈稳定态（Tris为三羟甲基氨基甲烷）EDTA（乙二胺四乙酸二钠）：是DNA酶的抑制剂，可以防止细胞破碎后DNA酶降解DNASDS（十二烷基磺酸钠）：可以使蛋白质变性，与DNA分离③过滤：在漏斗中垫上尼龙纱布，将菜花研磨液过滤到烧杯中(有条件的学校可将滤液倒入塑料离心管中进行离心，用1000r/min的转速，离心2～5min，取上清液放入烧杯中)。在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液④沉淀：将一倍体积的上清液倒入两倍体积的体积分数为95％的预冷乙醇溶液中，并用玻璃棒缓缓、轻轻地搅拌溶液(玻璃棒不要直插到烧杯底部)。沉淀3～5min后，可见白色的DNA絮状物出现。用玻璃棒缓缓旋转，将絮状物缠绕在玻璃棒上（三）结果分析与评价：观察提取的DNA颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多；二苯胺鉴定出现蓝色说明实验基本成功，如果不呈现蓝色，可能所提取的DNA含量低，或是实验操作中出现错误，需要重新制备。1、是否提取出了DNA本实验提取的DNA粗制品有可