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1实验题目：火腿肠亚硝酸盐含量测定学院生命科学学院专业食品卫生与安全年级2012级学号201224111322学生姓名刘素珊同组人员李楠、冯颖康、邱泽薇、卢于婷、莫彬妹任课教师李芸瑛实验时间2013年12月1日2前言亚硝酸盐，俗称工业用盐，常见的亚硝酸盐有亚硝酸钾和亚硝酸钠，为一种白色或微黄色结晶，有的为颗粒状粉末，无臭、味微咸涩，易潮解，易溶于水。亚硝酸盐作为一种良好的发色剂被广泛应用于肉制品中,因其具有抑制肉毒梭状芽胞杆菌的效力,在肉制品的保藏过程中发挥有益作用[1]。亚硝酸盐是作为发色剂使用于腌制香肠,腊肉和火腿等肉制品中，因其可缓慢地分解释放出氧化氮(NO)，使肉中的肌红蛋白亚硝基化形成稳定的亚硝基肌红蛋白色素，从而保持肉制品中的固有色泽；另一方面,亚硝酸盐还具有防腐作用，能够抑制肉毒梭状芽孢杆菌，防止肉类制品的腐败变质。但是，亚硝酸盐具有急性毒性作用，成人中毒量为0.2g－0.5g，致死量1g～2g[2]。亚硝酸盐在合适的条件下可生成亚硝酸化合物,它在体内与含蛋白食物中的仲胺合成亚硝胺,为强烈的致癌物质,对人体有极大的危害性。我国食品添加剂使用卫生标准规定在肉制品、火腿肠、灌肠类≤30μg/mL，香肠（腊肠）香肚、酱腌菜、广式腊肉≤20μg/mL。在使用时,必须严格控制其用量,所以对火腿肠中亚硝酸盐进行监测对指导生产和消费安全十分必要而具有重要意义。一、实验目的1掌握分光光度法测定香肠中亚硝酸盐的基本原理2掌握香肠的前处理及严格规范亚硝酸盐样品的提取3比较不同品牌的香肠中亚硝酸盐的含量4熟悉可见光分光光度计的使用及测定原理二、实验原理目前国内外用于肉制品中亚硝酸盐含量测定的方法主要有发光分析法、催化荧光光度法、气相色谱法、生物传感器法、离子色谱法、离子选择电极法和示波极谱法等。但是，上述方法有些要求的分析条件高、操作复杂、费用较高，所以，本实验用可见分光光度法测定火腿肠中亚硝酸盐的含量，实验是利用样品沉淀蛋白质、除脂肪后，在弱酸条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后，与盐酸萘乙二胺偶合成紫红色偶氮染料，在538nm处有最大吸收，线性范围在0－1.0μg/mL，用于肉制品中亚硝酸盐的含量，分析获得满意结果。该方法灵敏度高、操作简便快速、稳定性好、准确度高等优点。三、实验主要器材（1）绞肉机×1（2）研钵×33（3）50mL烧杯×1、100mL烧杯×5、500mL烧杯×3（4）50mL容量瓶×12、100mL容量瓶×1﹑500mL容量瓶×2（5）漏斗×3（6）量筒（7）温度计×1（8）滴管若干（9）水浴锅×1（10）分析天平×1（11）移液枪（枪头若干）（12）滤纸若干（13）玻璃棒×3（14）腊肠、双汇火腿肠、金锣火腿肠各一根（15）722型-分光光度计×1四、实验试剂（1）饱和硼砂溶液：称取5.0g硼砂（Na2BO4·10H2O）溶于100ml热水中，冷却后备用。（2）乙酸锌溶液：称取22g乙酸锌[Zn(CH3COO)2·2H2O]，加3mL冰醋酸溶于水，并稀释至100mL。（3）亚铁氰化钾溶液：称取10.6g亚铁氰化钾[K4Fe(CN)6·3H2O]溶于水，稀释至100mL。（4）4g/L对氨基苯磺酸溶液：称取0.4g对氨基苯磺酸于100mL20%盐酸溶液中，存放于暗处。（5）2g/L盐酸-萘乙二胺溶液：称取0.2g盐酸萘乙二胺，溶于100mL水中，存放于暗处。（6）亚硝酸钠标准溶液（200μg/mL）：精确称取0.1000g基准亚硝酸钠于500mL容量瓶中，加水定容到刻度线。（7）亚硝酸钠的标准使用液（5μg/mL）：临用前，吸取200μg/ml亚硝酸钠标准溶液2.5mL，用水定容到100mL。五、实验步骤（1）标准曲线的绘制取9支干净50ml容量瓶，按下列表1进行编号并加入试剂进行操作。于波长538nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，各试管标准液质量浓度(ug/ml)作为横坐标，绘制出标准曲线4表1.亚硝酸钠质量浓度---标准曲线的绘制（2）样品处理称取5.0g绞碎的火腿肠，置于50mL烧杯中----加12.5mL硼砂饱和溶液----搅拌均匀----以70℃左右的水约300mL，将火腿肠全洗入500mL容量瓶中-----置沸水浴加热15min-----取出后冷却至室温-----然后一面转动一面加入加5mL亚铁氰化钾溶液-----摇匀-----再加5mL乙酸锌溶液以沉淀蛋白质------加水至刻度-----混匀-----倒到500mL烧杯中，放置0.5h------除去上层脂肪-----清液用滤纸过滤，弃去初滤液30mL，滤液备用。（3）含量的测定分别吸取40ml三种经处理后的滤液于50mL容量瓶中-----分别加入2mL4g/l对氨基苯磺酸溶液-----混匀-----静置3～5min-----分别加入1mL2g/l的盐酸萘乙二胺溶液-----加水至刻度-----混匀-----静置15min-----后以试剂空白为参比，于波长538nm处测吸光光度。（4）结果处理根据所测样品的吸光度，在标准曲线上查得相应的亚硝酸钠质量浓度。做数据处理。按下式计算：(1)m=cv式中：m—试样测定液中亚硝酸盐的质量，µg；c—试样测定液中亚硝酸钠质量浓度，ug/mLV—试样测定液的体积，mL试剂123456789亚硝酸钠标准溶液使用液/ml0.000.200.400.600.801.001.502.002.504g/L对氨基苯磺酸溶液/ml222222222混匀，静置3～5min2g/L盐酸萘乙二胺溶液/ml111111111加水至刻度,混匀,静置15min，进行比色亚硝酸钠质量浓度/(ug/ml)00.020.040.060.080.100.150.200.25A53800.0170.0270.0490.0630.0790.1140.1590.2025m×10-3(2)X=————————v1M×——×10-3V2式中:X—试样中亚硝酸盐的含量，mg/kg；V1—测定时所取溶液体积，ml；V2—试样处理液总体积，ml；M—试样质量，g；m—试样测定液中亚硝酸盐的质量，µg；六、实验结果（1）标准曲线的绘制表2（2）样品亚硝酸盐含量计算根据表2，可以计算三种样品中亚硝酸盐的质量：m双汇=（0.094+0.0013）÷0.8018ug/mL×50mL=5.943ugm金锣=（0.028+0.0013）÷0.8018ug/mL×50mL=1.827ugm腊肠=（0.045+0.0013）÷0.8018ug/mL×50mL=2.887ug亚硝酸钠质量浓度--标准曲线y=0.8018x-0.0013R2=0.9984-0.0500.050.10.150.20.2500.050.10.150.20.250.3亚硝酸钠标准液质量浓度A538系列1线性(系列1)65.943×10-3X双汇=———————————=14.87540mL5g×————×10-3500mL1.827×10-3X金锣=———————————=4.56840mL5g×————×10-3500mL2.887×10-3X腊肠=———————————=7.21840mL5g×————×10-3500mL总结可得表3表3样品双汇泡面拍档金锣泡面伴侣腊肠A5380.0940.0280.045质量μg5.9431.8272.887亚硝酸盐含量mg/kg14.8574.5687.218七、注意事项1、处理样品时一定要在碱性条件下进行，pH约为9.18，因为锌盐沉淀蛋白质时，要求在碱性。二是碱性下处理肉制品，脂肪被皂化，减少样品被脂肪包裹，使亚硝基根更易提取到水溶液中，三是溶液在碱性下亚硝基根以离子存在，易溶且稳定。2、为了使亚硝酸提取完全，应该进行热处理，加热时间应控制好时间，约为15分钟。因为在加热下样品容易挥发，也易分解，造成损失。3、盐酸萘乙二胺有致癌的作用，使用时注意安全。4、生活饮用水中常存有微量的亚硝酸盐不能作为测定用稀释液。5、若显色后颜色很深且有沉淀产生或很快退色变成浅黄色，说明样品中亚硝酸盐含量很高，须加大稀释倍数重新测定。6、对超标样品应进行重复实验，有条件时送实验室准确定量。7八、结果分析与讨论（1）实验结果分析我国食品添加剂使用卫生标准规定在肉制品、火腿肠、灌肠类≤30μg/mL，香肠（腊肠）香肚、酱腌菜、广式腊肉≤20μg/mL。而根据实验结果，三种肠类亚硝酸盐含量均符合国家标准，结果令人满意。但双汇泡面拍档相比较而言，亚硝酸盐含量较高，建议在选择食用的时候，尽量避免选择。而且这一类的腌渍肉类产品一般亚硝酸盐含量较高，不建议长期食用。但是同样是火腿肠，金锣和双汇的亚硝酸盐含量差异有点大，怀疑是实验环节有偏差才导致的结果。（2）实验现象分析①在做标准曲线的溶液时，在亚硝酸钠标准液中加入4g/l对氨基苯磺酸溶液和2g/l的盐酸萘乙二胺溶液后，出现不同梯度的紫色变化，这是因为亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后，与盐酸萘乙二胺偶合成紫红色偶氮染料，亚硝酸盐越多，颜色越深。②在处理样品时，在火腿肠中加入硼砂饱和溶液，水浴加亚铁氰化钾溶液再加乙酸锌溶液，静置后，溶液出现分层，上层漂浮一层油状物，中层为清液，下层为乳白色悬浮物及不溶物，其实上层为油脂，中间为所需溶液，底层为蛋白质沉淀及未溶解的残渣。（3）试剂用途分析①饱和硼砂溶液：调节pH值，硼砂与酸反应生成硼酸，加入硼砂可使pH升高。②乙酸锌和亚铁氰化钾：共同作用生成氰化亚铁酸锌可与蛋白质共沉淀，澄清效果好。③4g/L对氨基苯磺酸溶液和2g/L盐酸-萘乙二胺溶液：弱酸条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后，与盐酸萘乙二胺偶合成紫红色偶氮染料。④亚硝酸钠标准溶液和亚硝酸钠的标准使用液：做标准液以绘制标准曲线。（4）可能影响实验的因素分析①在溶解乙酸锌溶液时，因乙酸锌结晶太大，转移时有质量亏损，可能影响浓度。②在制备亚硝酸钠标准溶液时，亚硝酸钠因为时间关系并没有进行干燥处理，可能会有残留水在其中，影响取量精确性。③在将样品进行沸水浴时，水温并未达到100℃，可能影响样品反应进行充分。④我们并未做多组实验以取平均值，可能导致数据出错而出现偏差。⑤样品可能为研磨得不够细致，导致在处理样品时，亚硝酸亚提取的不够，导致实验数据误差。（5）实验反思①配备溶液实在不容易，平时做实验的环境太优越，真正动手时却手足无措的。②实验不仅需要细心，需要耐心和毅力，不管失败多少次，都要继续重做，直到满意。③团队配合很重要，一个团队配合得好，事情可以事半功倍。④在做一个实验时，不止要先策划好实验的试剂流程，还要事先想好各种突发状况，做好充分色准备才能更好地完成实验。⑤我们并没有多做几组平行试验，无法进行比较，是我们的疏忽。⑥我们设计的样品对比性不够明显，应该选用同一种类的火腿肠的不同牌子会更有说服力。参考资料：百度上各种资料汇集