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分子生物学实验院系：生命科学与技术学院专业：生物科学（基地）班级：201101班学号：姓名：分子生物学基础实验分子生物学实验技术已成为生物化学及分子生物学以及相关学科院系教学科研不可缺少的一部分。为提高学生在分子生物学技术方面的动手能力，生物技术综合实验室主要开设常用而基本的分子生物学实验技术。它的内容包括质粒DNA的制备；DNA的重组；PCR基因扩增等等。实验一质粒DNA的小量制备一、实验原理要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体（vector）。载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。作为基因工程的载体必须具备下列条件:(1)是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；（3）载体DNA链上有1到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入；（4）载体具有选择性的遗传标记，如有抗四环素基因（Tcr），抗新霉素基因（Ner）等，以此知道它是否已进入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。细菌质粒具备上述条件，它是基因工程中常用的载体之一。质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1～120kb之间，具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制型（stringentcontrol）和松弛控制型（relaxedcontrol）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，它也不复制。每个细胞内只含有1个或几个质粒分子。后者的质粒在整个细胞周期中随时复制，在细胞里，它有许多拷贝，一般在20个以上。通常大的质粒如F因子等，拷贝数较少，复制受到严格控制。小的质粒，如ColEⅠ质粒（含有产生大肠杆菌素E1基因），拷贝数较多，复制不受严格控制。在使用蛋白质合成抑制剂－氯霉素时，染色体DNA复制受阻，而松弛型ColEⅠ质粒继续复制12－16h，由原来20多个拷贝可扩增至1000－3000个拷贝，此时质粒DNA占总DNA的含量由原来的2％增加到40％－50％。本实验分离提纯化的质粒pBR322、pUC19就是由ColEⅠ衍生的质粒。所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（SDS）可使细胞壁解，经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌染色体DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在清液中。用乙醇沉淀、洗涤，可得到质粒DNA。质粒DNA的相对分子量一般在106－107范围内，如质粒pBR322的相对分子质量为2.8×106，质粒pUC19的相对分子质量为1.7×106。在细胞内，共价闭环DNA（covalentlyclosedcircularDNA，简称cccDNA）常以超螺旋形式存在。如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫做开环DNA（opencircularDNA，简称ocDNA）。在电泳时，同一质粒如以cccDNA形式存在，它比其开环和线状DNA的泳动速度快，因此在本实验中，自制质粒DNA在电泳凝胶中呈现3条区带。二、实验目的1．掌握最常用的提取质粒DNA的方法和检测方法。2．了解制备原理及各种试剂的作用。三、实验材料和试剂材料：大肠杆菌E.coli，含pBR322质粒。试剂：1.LB培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/LNaCl，用NaOH调pH至7.3左右。如固体培养基则添加15g/L琼脂。2.溶液Ⅰ（pH8.0G.E.T缓冲液）：50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-HCl，10mmol/LEDTA。灭菌后存放。3.溶液Ⅱ（0.2mol/LNaOH(内含1％SDS)）：预先配制1％SDS母液，临用前一天晚上加入0.2mol/LNaOH，4℃保存。4.溶液Ⅲ（pH4.8乙酸钾溶液）：5mol/L乙酸钾60mL、冰乙酸11.5mL、双蒸馏水28.5mL。5.酚/氯仿液(V/V＝1/1)：酚为重蒸酚，配制时，先将氯仿中加入异戊醇，使其体积比为24:1，然后等量的加入重蒸酚，混匀，并用0.1mol/LTris-HCl(pH7.6)抽提几次以平衡这一混合物，于棕色瓶中存放，并在上面覆盖等体积的0.01mol/LTris-HCl(pH7.6)，4℃保存。6.无水乙醇7.70％乙醇8.pH8.0TE缓冲液：10mmol/LTris-HCl、1mmol/LEDTA，其中含RNA酶20μg/mL。仪器：恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、台式高速离心机、台式小型振荡器、EP管(1.5mL微量离心管)、加样器(20uL～lmL)、吸头。四、操作步骤（一）培养细菌将带有质粒pBR322的大肠杆菌接种在含50μg/mL氨苄青霉素(Amp)的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。注意：添加Amp时，须待LB培养基冷却到50℃左右方可加入。（二）从菌落中快速提取制备质粒DNA1．取1.4mL菌液置于1.5mLEp管中，7500rpm离心1min。2．弃上清，加入150μLGET缓冲液，在涡旋混合器上充分混匀，在室温下放置10min。3．加入200μL新配制的0.2mol/LNaOH(内含1％SDS)，加盖，颠倒（不要振荡）2～3次，使之混匀，冰上放置4min，最多不能超过5min。4．加入150μL冰冷的乙酸钾溶液。加盖后，颠倒数次使之混匀，冰上放置15min。5．10000rpm离心5min，上清液吸至另一干净的1.5mLEp中，如上清液浑浊则需重新离心一次。6．于上清液中加等体积酚/氯仿液，振荡混匀，12000rpm离心2min，小心吸取上清液，转移至另一1.5mLEp管中，注意勿将两液相中间的白色蛋白薄层吸出。7．向上清液加入2倍体积无水乙醇，混匀，室温放置３min。用离心机于10000rpm离心5min。倒去上清液。8．用0.5mL70％乙醇洗涤沉淀一次，10000rpm离心3min，除尽乙醇，室温自然干燥(将离心管倒置于一张纸巾上)，备用。9．用30uL含无DNA酶的胰RNase(20ug／mL)的TE重新溶解DNA，置于4℃保存，供下午电泳使用。这里因为要检测质粒是否提取成功以及提取质粒的浓度，故在此要进行一次电泳，下面为琼脂糖凝胶电泳的原理及方法：原理：根据DNA分子量不同，采用外加电场使其分开，用EB嵌入DNA分子后在紫外下显荧光。而荧光强度正比于DNA的含量，如将已知浓度的标准样品表2－1作为电泳对照，就可以估计出待测样品的浓度。电泳后的琼脂凝胶糖直接在紫外灯下拍照，只需要5－10ngDNA，就可以从照片上比较鉴别。由于电泳时所用的样品量非常少，只要将浓度控制在几十纳克即可，所以在基因工程中经常被用做检测DNA样品。表2－1λDNA/HindⅢ中DNA片断总DNA含量为100%琼脂糖凝胶板的制备1．琼脂糖凝胶的制备称取1.0g琼脂糖，置于锥形瓶中，加入100mLTBE缓冲液，于电炉上加热，注意：防止溢出，由于琼脂糖较难溶解，如果水分损失较大，则补充一定量的蒸馏水，使其终浓度为1％。2．胶板的制备将有机玻璃内槽洗净、晾干。取胶带纸将有机玻璃内槽的两端边缘封好，形成一个边脚模子。注意：将橡皮膏紧贴在有机玻璃内槽两端边上，不能留空隙。将有机玻璃内槽置于水平位置，放好样品槽模板(一般称之为梳子)，将冷却至65℃左右的琼脂糖凝胶，小心地倒在内槽上，控制灌胶速度，使胶液缓慢地展开，直到整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。室温下静置1h左右，待凝固完全后，轻轻拔出样品槽模板，撕去胶带纸，胶板上即形成相互隔开的样品槽。片段碱基对数目/kb相对分子质量DNA含量/%DNA含量/(ng/mg)123.13015.0×10647.7476.929.4196.12×10619.4194.136.5574.26×10613.5135.244.3712.84×106989.952.3221.51×1064.847.962.0281.32×1064.241.870.5640.37×1061.111.680.1250.08×1060.32.6将有机玻璃内槽放入电泳槽中，加入0.5×TBE电泳缓冲液，以盖过胶板为宜。胶板内的样品小槽3．加样用移液枪将上述样品分别加入胶板的样品小槽内，每次加完一个样品为了避免交叉污染，各样品用不同的枪头，以免造成限制酶被污染。加样时，枪头不要插入胶板内，防止碰坏样品槽周围的凝胶面，每个样品槽的加样量不宜过多，本实验加样为10uL左右。(每块胶板需点一个Marker，这里即为λDNA/HindⅢ)4．电泳加完样品后应立即通电，进行恒压电泳。在低压条件下，线形DNA片段的迁移速度与电压成比例关系，为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不应高于5V/cm。当溴酚蓝染料（蓝色）移动到距离胶板下沿约1～2cm处，停止电泳。5．染色将电泳后的凝胶浸入EB染液中，进行染色以观察在琼脂糖凝胶中的DNA带。染色20min后，用大量水冲洗。6．观察在波长为254nm的紫外灯下，观察染色后的电泳凝胶。DNA存在处显示出红色荧光条带。用凝胶自动成像仪处理代替。五、注意事项1．收集菌体提质粒前，培养基要去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮。2．在添加溶液Ⅱ与溶液Ⅲ后溶液的混合一定要柔和，采用上下颠倒的方法，千万不能在旋转器上剧烈振荡。其中加入溶液Ⅱ后，溶液变成澄清，并有黏性；加入溶液Ⅲ后，出现絮状沉淀。3．苯酚具有腐蚀性，能造成皮肤的严重烧伤及衣物损坏，使用时应注意。如不小心皮肤上碰到苯酚则应用碱性溶液、肥皂及大量的清水冲洗。4．苯酚可以用于抽提纯化DNA，由于苯酚的氧化产物可以使核酸链发生断裂。所使用的苯酚在使用前必须经过重蒸，且都必须用0.1mol/LTris-HCl(pH7.6)进行平衡。所以取酚/氯仿/异戊醇时应取下层溶液，因为上层是Tris-HCl液隔绝空气层。5．酚/氯仿/异戊醇抽提时，应充分混匀。经酚/氯仿/异戊醇抽提后，吸取上清液时注意不要把中间的白色层吸入，其中含有蛋白质等杂质。6．实验中，涉及酚/氯仿溶液的操作要格外小心，而且与之接触的吸头、Ep管，全部弃用，不回收。7．有些质粒本身可能在某些菌种中稳定存在，但经过多次移接有可能造成质粒丢失。因此不要频繁转接，每次接种时应挑单菌落。六、实验结果与分析提取质粒DNA后，经琼脂糖凝胶电泳，图谱如下：图中M为Marker，4号为本人所提取的质粒DNA凝胶电泳的检测图，本人所用的质粒为pEGFP-N3。由跑胶结果可知，质粒DNA分子条带较为明亮，说明所提取的DNA浓度很高；前面原理部分提到，质粒DNA分子的结构多样，包括超螺旋结构，开环结构以及线性结构等，它们在凝胶中的泳动速度不同，所以在图谱中显示有多条带；胶孔中比较亮的部分表明提取的质粒中有大量蛋白质残留；条带非常宽而且两侧有轻微的拖尾迹象表明点样时样品量加的过多，在质粒检测中可以适当减少加样量，使得条带清晰均匀一点。一般在实验室中，不会单独检测质粒DNA，或者检测质粒DNA时不用Marker，这主要是因为质粒DNA分子结构多样，在电泳图谱中并不能够正确显示其大小。七、思考题1．裂解细菌时需注意的事项有哪些？答：首先注意的是SDS-NaOH处理的时间。质粒制备过程中，如果质粒长时间暴露于NaOH,质粒有可能不可逆变性，使得抽提质粒中有部分是变性质粒。这些变性质粒，不能酶切。所有一般情况下，SDS-KOH处理时间不能超过5分钟，最好在冰里处理，观察到液体变得清就可以加入中和液。其次是在添加