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课题1微生物的实验室培养1.提供合适的营养和环境条件2.防止其他微生物污染2.基本成分：碳源、氮源、水、无机盐3.特殊营养：（有些微生物需要）（牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有）4.pH、氧气、二氧化碳、渗透压的需求：一、培养基如:生长因子(即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物,如维生素、某些氨基酸、碱基等)按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。1.概念：不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方营养物质定义作用主要来源碳源凡能提供所需碳元素的物质合成生物体的细胞物质和一些代谢产物；有些是异养生物的能源物质氮源凡能提供所需氮元素的物质合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物①无机化合物：CO2、NaHCO3等。②有机化合物：糖类、脂肪酸、花生粉饼、石油、牛肉膏、蛋白胨等①无机化合物：N2、NH3、铵盐、硝酸盐。②有机化合物：尿素、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏等自养微生物异养微生物注：含C、H、O、N的有机物是异养型微生物的碳源、氮源、能源，如牛肉膏硝化细菌营养物质定义作用主要来源生长因子生长必不可少的微量有机物酶和核酸的组成成分无机盐矿物质参与酶的组成；调节渗透压——水——作为溶剂和运输的介质；参与生化反应——牛肉膏、酵母膏、动物组织提取液等备注：(1)不同种类的微生物，对碳源的需要差别较大。(2)微生物最常利用的碳源是糖类，尤其是葡萄糖；最常利用的氮源是铵盐、硝酸盐。(3)对异养微生物来说，含C、H、O、N的化合物既是碳源又是氮源和能量来源。(4)微生物之所以需要补充生长因子，往往是由于缺乏合成这些物质所需要的酶或合成能力有限。划分标准培养基种类特点用途物理性质化学成分天然培养基合成培养基用途或功能鉴别培养基培养基的种类不加凝固剂加凝固剂，如琼脂工业生产，增加某某菌的浓度或产物微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种含化学成分不明确的天然物质工业生产培养基成分明确分类、鉴定在培养基中加入某种化学物质,以抑制不需要的微生物的生长,促进所需要的微生物的生长培养、分离出特定微生物在培养基中加入某种指示剂或化学药品,用以鉴别不同种类的微生物鉴别不同种类微生物选择培养基液体培养基固体培养基划分标准培养基种类特点用途物理性质培养基的种类不加凝固剂加凝固剂，如琼脂工业生产，有利于微生物的大量繁殖，从而增加某某菌的浓度或产物、显微直接计数法微生物分离、鉴定、培养菌落，进行活菌计数、保藏菌种、动植物的组织液体培养基固体培养基平板划线法，用于微生物的分离（简单）稀释涂布平板法，用于微生物的分离(复杂),活菌计数在固体培养基上的接种方法？？？加入青霉素(是抗生素，杀细菌)的培养基:不加氮源的无氮培养基:不加含碳有机物的无碳培养基:几种选择培养基举例：分离酵母菌、霉菌等真菌分离固氮菌分离自养型微生物唯一碳源为纤维素的培养基分解纤维素的细菌1.无菌范围：实验操作空间消毒操作者的手、衣着消毒实验用具灭菌实验操作过程2.消毒与灭菌?酒精灯旁操作超净工作台关键是防止外来杂菌的污染二、无菌技术耐高温需保持干燥的物品，160～170℃1～2小时接种环、接种针等金属用具70~75℃、30min80℃、15min100℃、5~6min消毒灭菌定义方法较为温和理化方法，杀死部分有害菌体（不包括芽孢、孢子）强烈的理化方法，杀死所有微生物（包括芽孢、孢子）煮沸消毒法巴氏消毒法化学药剂紫外线灼烧灭菌干热灭菌酒精、氯气、石炭酸等高压蒸汽灭菌培养基，100KPa、121℃、15～30min关键是防止外来杂菌的污染2.消毒与灭菌：二、无菌技术四、大肠杆菌的纯化培养分散成单个细胞,形成单个菌落3.功能：单个或少数菌体2.特征：大小、形状、光泽度、颜色、透明度等。鉴定菌种的重要依据固体培养基上大量繁殖子细胞群体(菌落)1.定义：㈠制备牛肉膏蛋白胨固体培养基1.计算：培养基用量依配方计算各成分的用量2.称量：3.溶化：牛肉膏黏稠，用称量纸称取牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加盖牛肉膏、称量纸、少量水加热溶解→取纸→蛋白胨、NaCl→琼脂→补水定容4.调pH、分装、封口：5.灭菌：6.倒平板：培养基、培养皿倒平板约50℃倒置：防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基倒置1.培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。学生看课P18平板划线法的操作在给学生看平板划线法的视频㈠制备牛肉膏蛋白胨固体培养基㈡纯化大肠杆菌：接种方法⑴:平板划线法：菌种划3个平板1个不划线1.接种：接种环防止划破培养基？（重复实验）（空白对照）四、大肠杆菌的纯化培养平板划线时不能划破培养基，为什么？一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物杀死上次残留的菌种，保证使下一次划线时，菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。操作的第一步灼烧接种环：每次划线之前都要灼烧接种环：在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环：2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。6支试管，分别加入9ml无菌水1ml1011ml1021ml1031ml1041ml1051ml106接种方法⑵:稀释涂布平板法：a.梯度稀释菌液：菌液微量移液器⑵稀释涂布平板法：a.梯度稀释菌液：b.涂布平板：不超过0.1ml1个不涂布作空白对照滴灼冷涂稀释103倍稀释104倍稀释105倍各梯度分别涂布3个平板(重复组，取平均值)平板划线法⑵稀释涂布平板法：涂布平板的所有操作都应该在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？答：应从操作的各个细节保证“无菌”，例如，酒精灯与培养皿的距离要合适，吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围，等等⑴平板划线法：㈠制备牛肉膏蛋白胨固体培养基㈡纯化大肠杆菌：1.接种：⑵稀释涂布平板法：2.培养：将接种后的培养基和一个未接种的培养基放入37℃恒温箱中培养12h～24h后，观察并记录四、大肠杆菌的纯化培养接种方法下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是()A.防止杂菌污染B.消灭杂菌C.培养基和发酵设备都必须灭菌D.灭菌必须在接种前B灭菌的目的是防止杂菌污染，但实际操作中不可能只消灭杂菌，而是消灭全部微生物。灭菌必须在接种前，如果接种后再灭菌就会把所接菌种也杀死。灭菌的目的发酵所用的微生物是灭菌后专门接种的五、课题成果评价培养12h与24h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，及时观察记录的同学会发现这一点。（一）培养基的制作是否合格如果未接种的培养基在恒温箱中保温1～2d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。（二）接种操作是否符合无菌要求如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。（三）是否进行了及时细致的观察与记录1.临时保藏：试管固体斜面培养基上4℃2.长期保存：菌种易被污染、变异甘油管藏1ml甘油＋1ml菌液－20℃六、课题延伸（菌种的保藏）本课题知识小结微生物的实验室培养培养基无菌技术制备牛肉蛋白胨固体培养基纯化大肠杆菌结果分析与评价培养基的类型培养基的营养物质避免杂菌污染的方法实验室常用的消毒方法实验室常用的灭菌方法平板划线法稀释涂布法（步骤）编号成分含量①粉状硫10g②（NH4）2SO40.4g③K2HPO44.0g④MgSO49.25g⑤FeSO40.5g⑥CaCl20.5g⑦H2O100ml例3．右表是某微生物培养基成分，请据此回答：（1）表中营养成分共有类。（2）右表培养基可培养的微生物类型是。自养型微生物3（3）若除去成分②（NH4)2SO4，加（CH2O），该培养基可用于培养。（5）不论何种培养基，在各种成分都溶化后分装前，要进行是。（6）右表中各成分重量确定的原则是。（7）若右表培养基用于菌种鉴定，应该增加的成分是。固氮微生物调整pH依微生物的生长需要确定琼脂（或凝固剂）课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数一、课题背景1、尿素的利用尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。2、细菌利用尿素的原因土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶CO(NH2)2脲酶+CO22NH3+H2O尿素是培养基中的唯一氮源，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源，才能生长。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。5、该培养基选择分解尿素的微生物的原理选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。1、显微镜直接计数：利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。㈡.统计菌落数目：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；缺点2.间接计数法（活菌计数法）⑴原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。⑵常用方法：稀释涂布平板法。每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。注意事项①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30——300的平板上进行计数。②为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。(即设置重复组求平均数)③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。（一）土壤取样（二）制备培养基（三）土壤样品的稀释（四）取样涂布（五）微生物的培养与观察（八）鉴定（七）细菌的计数二.实验的操作流程选择培养基（尿素培养基）牛肉膏蛋白胨培养基(作对照)（六）鉴定：筛选后必鉴定鉴别培养基：加入某种指示剂或化学药品，不影响微生物的生存1、酚红培养基：鉴定分解尿素的细菌。原理：脲酶催化尿素分解成氨→培养基碱性增强→酚红变红→脲酶阳性2、伊红—美蓝培养基：鉴定大肠杆菌原理：代谢产物与伊红—美蓝结合→菌落呈黑色并带有金属光泽。CO(NH2)脲酶+CO2NH3+H2O属鉴别培养基，它并没有促进大肠杆菌的生长和抑制其他微生物的生长操作实验组对照组判断培养基中是否有杂菌污染判断选择培养基是否具有筛选作用选择培养基接种选择培养基不接种选择培养基接种牛肉膏蛋白胨培养基接种需将未接种的选择培养基同时进行培养需设立牛肉膏蛋白胨培养基进行接种后培养，观察两种培养基上菌落数目、进行对比得出结金版P21实验设计原则(1)设