Affymetrix基因表达谱芯片操作指南(中文版)

Affymetrix基因表达谱芯片操作指南地址：上海市张江高科技园区李冰路151号电话：[phone]传真：[phone]的提取和纯化一、总RNA的提取(TRIzol)1．均质化a)组织：每50~100mg组织加入1mlTRIzol，然后用匀浆器将组织彻底打碎。b)细胞：每2×106细胞加入1mlTRIzol，用1ml移液器反复吹打。2．均质化的样品在15~30℃放置5分钟，然后加入0.2倍体积的氯仿，盖子盖紧后剧烈振摇15秒使混匀，在15~30℃放置2~3分钟，4℃7,000rpm离心15分钟，离心后形成下层红色的酚氯仿相，中间相和上层无色水相。3．将上层水相转移至一个新的离心管（水相的体积大约为均质化时所用TRIzol体积的60%），加入0.8倍体积的异丙醇，剧烈振摇使混匀，4℃7,000rpm离心15分钟，弃上清。4．加入70%酒精，颠倒离心管数次以洗去沉淀所含盐分。如沉淀较大可用Tip头先将沉淀打散。然后4℃7,000rpm离心10分钟，弃上清。5．重复以上步骤1次。6．15~30℃晾干，然后加入适量的无RNase的水溶解。7．用分光光度计分析RNA浓度，在260nm1OD约等于40μg/ml的RNA。a)需要在260和280nm测定吸光度来确定样品的浓度和纯度b)A260/A280应接近2.0为较纯的RNA(比值在1.9-2.1也可)8．1%琼脂糖电泳或AgilentBioAnalyzer二、RNA的纯化（QIAGENRNeasyTotalRNAIsolationkit）具体方法参见QIAGEN公司随试剂盒提供的操作手册三、Poly(A)+mRNA的提取（QIAGENOligotexDirectmRNAkit）具体方法参见QIAGEN公司随试剂盒提供的操作手册地址：上海市张江高科技园区李冰路151号电话：[phone]传真：[phone]的提取和纯化一、总RNA的提取(热酚法)1.10ml培养基中使酵母生长至对数期(OD600≈1.0)。2.将酵母转移至50ml离心管中，4℃，1,500g离心3分钟。3.弃上清，用1ml冰预冷的水重悬沉淀，转移至1.5ml离心管。4℃离心30秒。4.弃上清，400μlTES重悬沉淀，再加入400μlAcidPhenol，vortex上剧烈振荡1分钟。65℃温浴30分钟，每隔5分钟Vortex上振荡30秒。5.冰上放置5分钟，4℃最大速离心5分钟。6.将上层水相转移至一个新的Eppendorf管中，加入400μlAcidPhenol，Vortex上剧烈振荡，重复第5步。7.将上层水相转移至一个新的Eppendorf管中，加入400μl氯仿。Vortex上剧烈振荡，4℃最大速离心5分钟。8.将上层水相转移至一个新的Eppendorf管中，加40μl3M醋酸钠，1ml冰预冷的无水乙醇，4℃最大速离心10分钟。9.弃上清，70%乙醇洗一次。10.空气中晾干，适量的RNase-free水溶解。11.用分光光度计分析RNA浓度，在260nm1OD约等于40μg/ml的RNA。a)需要在260和280nm测定吸光度来确定样品的浓度和纯度b)A260/A280应接近2.0为较纯的RNA(比值在1.9-2.1也可)12.1%琼脂糖电泳或AgilentBioAnalyzer二、RNA的纯化（QIAGENRNeasyTotalRNAIsolationkit）具体方法参见QIAGEN公司随试剂盒提供的操作手册地址：上海市张江高科技园区李冰路151号电话：[phone]传真：[phone]一、准备Poly-ARNAControl浓的Poly-AControlStock可以用Poly-AControlDilBuffer稀释并直接加入RNA样品中，稀释倍数见下表。StartingAmountSerialDilutionsTotalRNAmRNAFirstSecondThirdSpike-inVolume1μg1:201:501:502μL5μg1:201:501:102μL10μg0.2μg1:201:501:52μL举例来说，准备poly-ARNA稀释液用于5μg总RNA样品中1.取2μLPoly-ARNAControlStock，加入38μL的Poly-AControlDilBuffer(1:20稀释)。2.混匀，离心将液体收集在管底。3.从第一次稀释液中取2μL再加入98μL的Poly-AControlDilBuffer(第二次1:50稀释)。4.混匀，离心将液体收集在管底。5.从第二次稀释液中取2μL再加入18μL的Poly-AControlDilBuffer(第三次1:10稀释)。6.加2μL第二次稀释液至5μg总RNA样品中。二、第一链cDNA合成a)PrimerHybridization在Eppendorf管中加入下列试剂，然后70℃温浴10分钟，稍微离心，立即放置冰上至少2分钟。反应试剂体积(1-8μgRNA)体积(8.1-16μgRNA)T7-(d7)24primer50μM2μl（100pmol）2μl（100pmol）RNA1-8μg8.1-16μg稀释的Poly-AControl2μl2μlDEPC水到12μl到11μl地址：上海市张江高科技园区李冰路151号电话：[phone]传真：[phone])温度调节在相应Eppendorf管中加入下列试剂，混合均匀，42℃温浴2分钟。反应试剂体积5×FirststrandcDNAbuffer4μl0.1MDTT2μl10mMdNTPmix1μlc)第一链合成z1-8μg总RNA:1μLSuperScriptIIz8.1-15μg总RNA:2μLSuperScriptIIz每1μgmRNA加1μLSuperScriptII.z少于1μgmRNA加1μLSuperScriptII.在反应管中加入相应体积的SuperScriptII，混合均匀，42℃温浴1小时，反应结束放置冰上至少2分钟。三、第二链DNA合成1.第一链反应完毕放置冰上。稍微离心甩下管壁试剂2.在第一链合成的管中加入下列第二链反应试剂（见表2）表2第二链合成成分成分体积终浓度或量DEPC处理水91μl5×SecondstrandcDNAbuffer30μl1×10mMdNTP3μl200μMeach10U/μlE.coliDNA连接酶1μl10U10U/μlE.coliDNA聚合酶I4μl40U2U/μlE.coliRnaseH1μl2U终体积130μl地址：上海市张江高科技园区李冰路151号电话：[phone]传真：[phone]混匀。稍微离心，16℃放置2小时。4.加2μl10U/μlT4DNA聚合酶。5.16℃放置5分钟。6.加10μl0.5MEDTA终止反应。7.继续纯化cDNA步骤，或-20℃储存。四、纯化双链DNA1.在合成的双链cDNA产物中加入600μLcDNABindingBuffer，在Vortex上混匀3秒。2.检查混合物的颜色是否为黄色。3.把500μL样品加入cDNACleanupSpinColumn，≥8,000×g(≥10,000rpm)离心1分钟，弃流出液。4.把剩余的样品加入离心柱，以上述同样的方法离心。弃流出液和收集管。5.把离心柱转移至一个新的收集管。加入750μLcDNAWashBuffer至离心柱内。≥8,000×g(≥10,000rpm)离心1分钟，弃流出液。6.打开离心柱管盖，以最大速度离心5分钟(≤25,000×g)，弃流出液和收集管。打开管盖离心可以确保离心柱内膜的干燥。注意：zcDNAWashBuffer使用前加入24mL无水乙醇。z所有步骤需在室温下完成，中间不能有停顿。z如果混合液的颜色为橙色或紫色，加如1μL的3M醋酸钠,pH5.0，并混匀。颜色会变为黄色。7.把离心柱转移至一个新的1.5mL收集管T，加入14μL的cDNAElutionBuffer。室温下静置1分钟。以最大转速(≤25,000×g)离心1分钟洗脱DNA。一般14μL的洗脱液可以收集到约12μL流出液。地址：上海市张江高科技园区李冰路151号电话：[phone]传真：[phone]×IVTLabelingBuffer4μL4μlIVTLabelingNTPMix12μlIVTLabelingEnzymeMix4μl加水至终体积40μl表2所需模板DNA的体积(按总RNA的量计算)总RNA（μg）模板DNA体积1.0-8.012μl8.1-16.06μl注：该表假设在第二链合成并纯化完后，收集到12μl模板DNA溶液2.37℃温浴16小时，每隔30～45分钟600rpm振荡10秒3.QIAGENRNeasyTotalRNAIsolationkit纯化生物素标记的cRNA具体方法参见QIAGEN公司随试剂盒提供的操作手册建议：z保存部分没纯化的cRNA产物进行凝胶电泳分析。z先纯化一半的cRNA产物，在纯化另一份前测定cRNA量。z洗涤和洗脱之前将样品过柱两次。z洗脱RNA时加水到柱子后，静置一分钟，再离心。4.cRNA质控用分光光度计分析RNA浓度。z需要在260和280nm测定吸光度来确定样品的浓度和纯度地址：上海市张江高科技园区李冰路151号电话：[phone]传真：[phone]应接近2.0为较纯的RNA(比值在1.9-2.1也可)5.按下面的计算公式确定调整cRNA的含量：调整cRNA含量=RNAm-(totalRNAi)(y)RNAm=IVT后测得cRNA量(μg)totalRNAi=开始总RNA的量(μg)y=在IVT过程中使用的cDNA的倍数地址：上海市张江高科技园区李冰路151号电话：[phone]传真：[phone]杂交一、片断化cRNAa)在新的1.5mLRNase-free离心管中按表1加入样品表1片断化反应成分体积20μgcRNA1-32μl5×FragmentationBuffer8μlRNase-free水到40μl2.94℃，35分钟。反应结束后放置冰上。3.变性凝胶电泳，至少需要1μgcRNA。二、杂交1.芯片使用前需平衡至室温。2.确定芯片的类型(Micro/MiniArray,MidiArray,StandardArray)。3.在新的1.5mLRNase-free离心管中按表2配制杂交液。4.杂交液先99℃，5分钟，然后45℃，5分钟。5.在进行上述步骤的同时通过加样孔加入适量体积（见表3）1×杂交缓冲液湿润芯片。4.杂交炉中45℃，60rpm预杂交芯片10分钟5.步骤4处理过的样品最大速离心5分钟。6.从芯片中取出杂交缓冲液，加等体积处理好的杂交液7.杂交炉中45℃，60rpm杂交芯片16小时地址：上海市张江高科技园区李冰路151号电话：[phone]传真：[phone]终浓度片断化cRNA5μg10μg15μg0.05μg/μlControlOligonucleotideB2(3nM)1.7μl3.3μ