9讲第1节-转基因动植物生物反应器

第四篇生物制品生产第9讲转基因生物反应器1896192019872006本讲主要内容1.转基因动植物生物反应器2.转基因细胞生物反应器本讲关键问题1.转基因动物、植物构建方法2.高效表达异源蛋白的策略第一节转基因动物植生物反应器在力学强度上，蛛丝纤维能和用来制造防弹衣和轻型头盔的凯夫拉尔纤维相媲美，其所含牵丝蛋白的强度比钢还要高出十几倍；在柔韧性上，蛛丝可被拉伸到原来长度的1倍到1.5倍而不发生断裂，弹性极佳。问题：能否养殖蜘蛛生产天然蛛丝呢？蜘蛛从来都不是一个勤奋的吐丝者，天然蛛丝主要用于结网，产量极低。蜘蛛性情凶猛，全为肉食，有互相残杀习性，故单独饲养容易成功，群养较难。蚕的一生经过蚕卵—蚁蚕—熟蚕—蚕茧—蚕蛾，共四十多天的时间春蚕到死丝方尽——《无题》唐李商隐家蚕生物反应器2011-04-20：美国圣母大学和怀俄明大学的研究人员将蛛丝蛋白基因插入到了家蚕的基因中，成功培育出了一种转基因家蚕，从而使家蚕吐出与蛛丝类似的超级蚕丝。与天然蚕丝相比，这种新纤维强度更大柔韧性也更好。可在军事、医疗、纺织等领域发挥重要作用：强度更好、更柔软、更贴身的防弹衣；更为柔软、结实的手术缝合线；既柔软舒适又结实耐用的高级时装。其它：降落伞、武器装备防护材料、车轮外胎、高强度渔网等。一转基因生物反应器转基因技术（Transgenictechnique）：通过人工方式将外源基因整合到生物体基因组内，并使该转基因生物能稳定地将此基因遗传给后代的技术。转基因生物反应器（Transgenicbioreactor）：将外源基因转入细胞或动植物，利用细胞增殖或者动植物代谢制备外源基因的表达产物的技术。细胞水平转基因微生物生物反应器：由于微生物结构简单、繁殖迅速、容易培养而成为转基因对象，主要采用遗传背景清楚的大肠杆菌和酵母表达系统，通过高密度发酵培养、分离纯化获得所需要的目的产物，生产的药物属于第一代基因工程药物。转基因动物细胞生物反应器：将外源基因转入动物细胞，表达制备相关产品。利用转基因动物细胞生产蛋白类药物、疫苗、细胞因子等产品已经成为生物制药的热点。转基因植物细胞生物反应器：将外源基因转入植物细胞，表达制备相关产品。由于植物细胞大规模培养技术限制，目前利用转基因植物细胞大规模生产基因工程产品有一定难度。个体水平转基因动植物生物反应器：将外源基因转入动植物个体，表达制备相关产品。转基因动植物技术不仅限于转基因技术，而且还涉及植物组织培养、动物胚胎工程等技术，因此过程复杂。利用转基因动物生产人类药用蛋白等是目前世界上转基因动物研究的热点之一。二转基因动物生物反应器1.转基因动物（transgenicanimal）：是指在基因组内稳定地整合外源基因，并且外源基因可以稳定地遗传给后代的基因工程动物。2.转基因动物培育方法（1）显微注射法优点：大片段、应用广流程：目的DNA制备DNA的注入原核胚胚胎体外培养胚胎移植（移植前鉴定）发育出生、鉴定两种策略1980年，Gordon等人首先育成转生长素基因小鼠。世界第一个转基因动物。生长速度快2－4倍、体形大一倍的转基因“硕鼠”。发表在1982年的nature杂志上。（2）胚胎干细胞方法胚胎干细胞（ES）是一种含正常二倍染色体的具有发育全能性的细胞，因此只要将外源DNA导入胚胎干细胞就可以实现基因的转移。（3）病毒法杆状病毒表达系统(BaculovirusExpressionVectorSystem,BEVS)，是将外源基因插入杆状病毒载体中，转染入昆虫细胞中表达。已有上千个外源基因在该系统中得到高效表达。3.转基因动物生物反应器应用举例（1）家蚕生物反应器1）应用新型蛋白产品：材料用、医药用；酶基因工程疫苗2）构建转基因家蚕：目前常用家蚕核型多角体病毒(BmNPV)作为载体表达外源基因。用5号昆虫种针醮取病毒液，从环节处穿刺接种，经75%酒精体表消毒蚕蛹。家蚕核型多角体病毒(BmNPV)载体优点病毒基因组中多角体蛋白polyhedrin基因容量大，适于插入外源基因的多拷贝。在多角体蛋白启动子的控制下,外源基因能高水平表达。重组病毒能在蚕体内表达，表达产物稳定。表达的产物分泌到细胞外面不致引起病毒或细胞的早日破裂，也有利于产物的分离提取。病毒对脊椎动物无致病性。（2）乳腺生物反应器1）乳腺生物反应器是将外源基因置于乳腺特异性调节序列之下，使之在乳腺中表达，然后通过回收乳汁获得重要价值的生物活性蛋白的技术。1987年Gordon等将组织型纤溶酶原激活剂(tPA)与小鼠乳清酸蛋白(WAP)基因的启动子构成重组基因，成功地培育出了37只在乳汁中能表达tPA的转基因小鼠.2006年6月2日，世界上第一个利用转基因动物乳腺生物反应器生产的基因工程蛋白药物——重组人抗凝血酶Ⅲ（商品名：ATryn）上市获得批准。目前，α1-抗胰蛋白酶(AAT)、人乳球蛋白、凝血因子III、IV、VIII、纤维蛋白原、降钙素、SOD、红细胞生成素、IGF-1等成功表达，多种药用蛋白已经进入临床试验阶段。特点1）生物学活性和功能与天然蛋白完全相同（经过充分的修饰加工，具有稳定的生物活性）。2）对动物的生理影响较小（乳腺是一个外分泌器官，乳汁不进入体内循环。3）表达产量高、表达产物的提纯相对容易、生产成本相对较低。4)表达产品的安全性好。牛：吃的是草，挤出的是奶转基因牛：吃的是草，挤出的是药！上海交通大学医学遗传研究所：（1）1998年中国首头转基因羊。乳汁中表达人凝血因子IX蛋白。人凝血因子IX是治疗血友病的药物。（2）1999年，带有人血清白蛋白基因的转基因试管牛——“滔滔”降生。关键技术环节使用合适的乳汁蛋白基因调控元件，构建合理有效的乳腺组织特异性表达载体。目前应用于乳腺特异性表达载体构建的乳蛋白基因及调控序列的主要有：乳清酸蛋白(WAP）基因及其调控序列。酪蛋白(Icasein)基因及其调控序列。β-乳球蛋白(β-lactoglobulin)基因及其调控序列。乳白蛋白(α-lactalbumin)基因及其调控序列。目的基因的鉴定：检查动物体内是否有外源基因的存在，以判明是否是转基因动物。可用聚合酶链反应(PCR)、斑点杂交(Dotbloting),Southern印迹分析等多种方法进行检测。目的蛋白的鉴定：建立动物乳腺生物反应器的最终目的是得到有活性的外源蛋白，因此，对目的蛋白的检测非常重要。检测方法主要有：(1)SDS－聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)(2)酶联免疫吸附实验(ELISA)(3)Western印迹分析转基因动物的鉴定问题1）理论基础薄弱和技术不完善，致使转基因在受体动物基因组随机整合，遗传不稳定、表达率不高。2）异位表达和表达产物的泄漏问题，需要乳腺组织特异性高效表达载体，保证外源基因在乳腺中专一表达。3）在家畜转基因技术方面，目前多用原核胚胎显微注射，平均成功率比较低，需要大量的供体和受体动物。1.转基因植物（transgenicplant）：指将外源基因转入到植物的细胞或组织获得了新的遗传性状的植物。三转基因植物生物反应器2.培育方法a：基因枪法b：根癌农杆菌共培养外源目的基因转化植物细胞西红柿疫苗3.应用生产各种疫苗用的抗原蛋白：1992年，美国人C.J.Arntzen和H.S.Mason率先提出了用转基因植物生产疫苗的新思路。此后，国内外相继在烟草、马铃薯、番茄、苜蓿和莴苣中表达了乙肝表面抗原、大肠杆菌热敏毒素B亚基、霍乱毒素B亚基、诺瓦克病毒壳蛋白和狂犬病毒G蛋白等抗原，并利用在植物中表达的抗原进行了动物和人体的免疫实验，为利用转基因植物生产疫苗奠定了良好基础。已有几十种药用蛋白质或多肽在植物中得到成功表达4.优点生物活性好：能进行有效的翻译后加工，是能够大规模也是最经济的生产蛋白质的生产系统。构建容易：植物细胞易再生植株，生长周期短，易于快速筛选出转基因阳性植株。不仅比构建动物生物反应器节省时间，而且技术更成熟，成功率更高。成本低：外源基因可以通过种子遗传给下一代，扩大种植大面积提高产量。使用安全：表达系统中的非目的成分对动物无害，不存在其他动物病原体污染的可能，对人畜安全。免疫效果好：植物细胞中的疫苗抗原通过胃内的酸性环境时可受到细胞壁的保护，直接到达肠内黏膜诱导部位，刺激黏膜和全身免疫反应。四应用举例piggyBac载体小结转基因动物生物反应器转基因生物反应器谢谢