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课题1DNA的粗提取与鉴定一.基础知识DNA粗提取的基本思路：利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。1.提取生物大分子的基本思路：选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。2.DNA的理化特性1)DNA的溶解性在NaCl溶液浓度在0.14mol/L时,DNA溶解度最小；低于(或高于)0.14mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的降低(或增加)而逐渐增大。DNA的不溶于酒精，某些蛋白质溶于酒精2)DNA的其它特性①蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响②大多数蛋白质不能忍受60－80℃的高温，而DNA在80℃以上才会变性③洗涤剂可以瓦解细胞的细胞膜，但对DNA没有影响3.DNA的鉴定原理1)DNA＋二苯胺试剂沸水浴溶液变蓝色2)DNA可被甲基绿染成绿色一)实验原理二.实验设计1.破碎细胞，释放核物质动物细胞加蒸馏水让细胞吸水胀破,过滤得滤液植物细胞加洗涤剂和食盐,充分研磨蒸馏水对于鸡血细胞来说是低渗溶液,水分可大量进入鸡血细胞,是细胞胀裂,从而释放DNA搅拌可加速细胞破裂讨论：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？二)实验材料的选取选DNA含量较高的生物组织作为材料,成功可能性更大材料：可选鱼卵、猪肝、鸡血2.除去杂质，分离出DNA用浓度为2mol/L的NaCl溶液溶解DNA,逐渐加水稀释,当降至0.14mol／L时(溶解度最低)可以使DNA析出向DNA的盐溶液，逐渐加酒精，可析出DNA三)实验步骤1.0.1g/ml的柠檬酸钠溶液,按1:2的比例与新鲜鸡血混合搅拌均匀，将血液置于冰箱中24小时,弃上部澄清液鸡血加入柠檬酸钠溶液液，是为了防止血液凝固。三)实验步骤2.取烧杯中的血细胞液约5~10ml加入到100ml烧杯中，向烧杯中加入20ml蒸馏水，用玻棒沿一个方向快速搅拌5分钟，加速血细胞在低渗溶液中的破裂3.将2mol/L的氯化钠溶液50ml缓缓倒入烧杯中，用玻棒沿一个方向搅拌，使DNA溶解于氯化钠溶液中，过滤取滤液三)实验步骤4.将鸡血细胞DNA提取液置于较大的烧杯中，沿烧杯内壁缓缓倒入蒸馏水，并不断搅拌，直到粘稠状DNA不再析出为止。用玻棒搅拌，使析出的DNA缠绕于玻棒末端。5.将析出的DNA再溶解于2mol/L的氯化钠溶液中。6.在DNA的氯化钠溶液中倒入95%的酒精50ml（冷却过的酒精效果较好)，使DNA再次析出，用玻棒搅拌，使DNA再次缠绕于玻棒末端。2mol/LNaCl溶液冷酒精三)实验步骤7.DNA的鉴定：取两支试管，各加入2ml0.015氯化钠溶液，将DNA溶解于其中一支试管中，另一支做为对照组。然后，在两支试管内加等量的二苯胺试剂，水浴加热10min左右，冷却，观察实验现象。例1.下列关于DNA的叙述正确的是(）A.随着氯化钠溶液浓度增大，DNA在氯化钠溶液中的溶解度也增大B.随着氯化钠溶液浓度的减小，DNA在氯化钠溶液中的溶解度也减小C.DNA不溶于酒精，也不溶于0.14mol/L的氯化钠溶液D.DNA与二苯胺试剂在沸水中加热，溶液变蓝色D例2.鸡血中含大量红细胞，实验室常用鸡血提取DNA。根据DNA提取实验，完成下列各题。1.为了防止鸡血凝血需加入的试剂是。2.将鸡血离心，取下层，除去上清的目的是3.向DNA的氯化钠溶液缓缓加蒸馏水，直至析出DNA不再增加，此时氯化钠溶液的浓度约为.柠檬酸钠去杂质0.14mol/L4.若没鸡血，能否用牛羊血代替？为什么？5.若用菜花进行提取,需加入,并充分研磨洗涤剂和食盐课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段（PCR）一、基础知识一)PCR原理PCR是一种在体外快速扩增特定基因或DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。1.PCR的反应条件一定的缓冲溶液--维持pH；DNA模板；分别与两条模板链相结合的两种引物；四种脱氧核苷酸；耐热的DNA聚合酶；控制温度因此，DNA复制方向：只能从子链的5’端到3’端延伸2.DNA复制的方向DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能将核苷酸连接到DNA片段的3’端。引物能与母链的一段碱基序列互补配对的一小段单链DNA片段或RNA且需要引物(20～30个核苷酸)PCR技术通过控制温度来控制双链的解旋与结合DNA在80～100℃时双螺旋结构将解体,双链分开;当温度降低后双链又能重新结合成双螺旋结构因此,PCR过程无需解旋酶,但需耐高温的DNA聚合酶3.DNA的热变性原理二)PCR的反应过程1.变性：2.复性：3.延伸：循环升高温度到900C以上DNA解聚为单链温度降到500C左右两种引物与两条单链DNA结合升温度升到700C左右在DNA聚合酶的作用下用溶液中的脱氧核苷酸根据碱基互补配对原则合成新DNA链一)实验操作步骤准备好PCR反应体系的配方用微量移液器按配方在往微量离心管中加入各组分盖严盖子，用手指轻轻弹击管壁混合反应液离心10S将离心管放入PCR仪上,设置好循环程序进行反应二、实验操作二)操作提示PCR技术高度灵敏，为了避免外源DNA等因素的污染而造成干扰实验，PCR操作时要注意做到：①隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压蒸汽灭菌；②所用试剂在-20℃保存，使用时，放在冰块上慢慢融化。③分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头。三、结果分析与评价---DNA含量的测定1、测定的原理可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关。2、过程①稀释：2uLPCR反应液，加入98uL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释。②对照调零以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零。取DNA稀释液100uL至比色杯中，测定260nm处的光吸收值③比色④计算DNA含量(g/mL)＝50x(260nm的读数)x稀释倍数50：1g/mL的DNA在厚度为1cm比色杯中的吸光值为0.02课题3血红蛋白的提取和分离课题3血红蛋白的提取和分离基础知识一)凝胶色谱法根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小，来进行分离。1.概念：思路利用不同蛋白质分子的特性(形状、大小、带电情况等)差异，分离不同种类的蛋白质课题3血红蛋白的提取和分离基础知识一)凝胶色谱法2.原理：2）①当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢;②而相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。1)凝胶是由多糖类化合物(如葡聚糖)构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道。课题3血红蛋白的提取和分离基础知识二)缓冲液1.概念:在一定的范围内，凡是能够抵制外加少量强酸或强碱的影响使原来溶液PH值基本保持不变的混合溶液。能够抵制外界的酸和碱对溶液PH值的影响，维持PH基本不变。2.作用:课题3血红蛋白的提取和分离实验操作蛋白质的提取和分离步骤：1.样品处理2.粗分离3.纯化4.纯度鉴定课题3血红蛋白的提取和分离实验操作1.样品处理:1)红细胞的洗涤:目的:去除杂蛋白b低速短时间离心操作:a采集血样d盐水洗涤c吸取血浆上层透明的黄色血浆重复bcd步骤三次用五倍体积的质量分数为0.9％的NaCl溶液洗涤加抗凝剂－－柠檬酸钠课题3血红蛋白的提取和分离实验操作1.样品处理:2)血红蛋白的释放：加蒸馏水到原血液体积,再加40％体积的甲苯,置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟(加速细胞破裂)细胞破裂释放出血红蛋白。3)分离血红蛋白溶液：课题3血红蛋白的提取和分离实验操作1.样品处理:3)分离血红蛋白溶液：过程：离心(以2000r/min,10min)过滤(用滤纸,除去脂溶性沉淀层)分离(用分液漏斗,分出下层的红色透明液体)课题3血红蛋白的提取和分离实验操作2.粗分离－－透析③过程：①透析目的：除去样品中分子量较小的杂质②原理：利用透析袋的半透性某些杂质分子比血红蛋白分子小，可透过透析袋课题3血红蛋白的提取和分离实验操作3.纯化1)凝胶色谱柱的制作：①玻璃管②底塞的制作③顶塞的制作④组装⑤安装其他附属结构原理用凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去步骤课题3血红蛋白的提取和分离实验操作3.纯化步骤2)凝胶色谱柱的装填①凝胶的选择②凝胶的前处理③凝胶色谱柱的装填方法注意:a凝胶装填时尽量紧密,以降低凝胶颗粒之间的空隙b装填凝胶柱时不得有气泡存在课题3血红蛋白的提取和分离实验操作3.纯化步骤2)凝胶色谱柱的装填①凝胶的选择②凝胶的前处理③凝胶色谱柱的装填方法注意:a凝胶装填时尽量紧密,以降低凝胶颗粒之间的空隙b装填凝胶柱时不得有气泡存在④洗涤平衡注意：a液面不要低于凝胶表面，b不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象3.样品的加入和洗脱1.调液面2.加样3.再调液面4.洗脱5.收集缓冲液凝胶课题3血红蛋白的提取和分离实验操作3.纯化步骤3)样品加入与洗脱注意：a不要触及并破坏凝胶面。b贴壁加样。c使吸管管口沿管壁环绕移动。课题3血红蛋白的提取和分离实验操作4.纯度鉴定SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳2.试剂的配制：鉴定血红蛋白纯度。1.目的：3.电泳方法步骤略课题3血红蛋白的提取和分离基础知识三)电泳1.概念:带电粒子在电场作用下发生迁移的过程2.类型:琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳课题3血红蛋白的提取和分离SDS--聚丙稀酰胺凝胶电泳法SDS十二烷基硫酸钠作用:能使蛋白质变性(解聚);消除净电荷对迁移率的影响,使电泳迁移率完全取决于分子的大小。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素洗涤剂能溶解细胞膜，使膜瓦解，利于释放DNA食盐主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解细胞内的DNA释放不完全,提取的DNA量变少；导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色。植物细胞加洗涤剂和食盐,充分搅拌研磨,过滤得滤液讨论：如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？1.以血液为实验材料时，每100ml血液中需要加入3g柠檬酸钠，防止血液凝固。2.加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫，不利于后续步骤的操作。加入酒精和玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。3.二苯胺试剂要现配现用,否则会影响鉴定的效果三.操作提示参考资料