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第一节雄性生殖毒性第二节雌性生殖毒性第三节致畸试验第四节繁殖试验第七章化学毒物的生殖毒性第一节雄性生殖毒性一、精子子的生成过程精原细胞→初级精母细胞→次级精母细胞→精子细胞→精子二、毒物对雄性生殖影响1、对睾丸生精细胞的影响；2、对内分泌功能的影响；3、对性功能和生殖功能的影响。三、雄性生殖毒性的检测方法•1、精子生成分析①精子计数；②精子形态观测；③精子状态分析试验2、精子穿透试验判断精子的受精能力。3、睾丸中标酶活性的测定主要检测乳酸脱氢酶X（LDH-X)、山梨醇脱氢酶、6－磷酸葡萄糖脱氢酶的变化，并结合精子生成过程中各阶段细胞的功能和形态学改变，来探明其毒性作用的部位和机理。4、体外试验主要将与生殖相关的细胞在体外条件下进行培养，并与受试外源化学物接触，观测其与生殖相关细胞的变化。5、雄性激素检测主要检测卵泡激素（FSH）、黄体激素（LH）和雄性激素。6、显性致死试验接受受试化学物的雄性毒物与未经受试物处理的雌性动物交配，观测雌性动物早期胚胎死亡情况，以评价受试动物是否对雄性动物的生殖有损害作用。7、雄性生殖细胞遗传毒性检测判断生殖细胞DNA是否受毒物损伤的一个评价指标。常用的方法为单细胞凝胶电泳试验，电泳结果呈彗星状，说明DNA受损，电泳结果呈条状。8、雄性生殖毒性病理检测第二节雌性生殖毒性一、雌性生殖细胞的生成过程初级卵母细胞→次级卵母细胞→卵子二、外源化学物的雌性生殖毒性表现1、对卵细胞的影响2、对内分泌功能的影响3、其它毒性作用如对子代造成畸形、死胎、功能发育不全等。三、雌性生殖毒性的检测方法1、体外试验对外源化学物作用的雌性生殖部位进行相应的检测。如下丘脑GnRH的合成与分泌对应激素检测；FSH、LH及甾体的受体进行分析。2、动物试验观测①发情周期的观察②排卵的观察③雌性激素检测④病理组织学检查反应停thalidomide第三节致畸试验第三节致畸试验•一、基本概念•生殖毒性(reproductivetoxicity)外源化学物对生殖过程的损害作用，主要包括对生殖细胞发生,卵细胞受精,胚胎形成,妊娠,分娩和哺乳过程的损害作用。评定方法即为生殖毒性试验。•发育毒性(developmentaltoxicity)外源化学物对胚胎发育,胎仔发育以及出生幼仔发育的损害作用。评定方法称为发育毒性试验,其中主要为致畸试验.一、基本概念发育毒理学(developmentaltoxicology)主要研究外源化学物对胚胎发育、胎仔发育以及出生幼仔发育的影响及其评定，评定方法称为发育毒性试验，其中主要为致畸试验。发育毒性(developmentaltoxicity)指出生前经父体和(或)母体接触外源性理化因素引起的在子代到达成体之前出现的有害作用。具体表现可分为:生长迟缓:即胚胎与胎仔的发育过程在外源化学物影响下，较正常的发育过程缓慢。致畸作用:由于外源化学物干扰，活产胎仔胎儿出生时，某种器官表现形态结构异常。功能不全或异常:即胎仔的生化、生理、代谢、免疫、神经活动及行为的缺陷或异常。胚胎或胎仔致死作用:某些外源化学物在一定剂量范围内，可在胚胎或胎仔发育期间对胚胎或胎仔具有损害作用，并使其死亡。畸形、畸胎和致畸物畸形(malformation):器官形态的异常。畸胎(terate):具有畸形的胚胎或胎仔。致畸物或致畸原(teratogen):凡在一定剂量下，能通过母体对胚胎或胎儿正常发育过程造成干扰，使子代出生后具有畸形的化合物。致畸试验:评定外源化学物是否具有致畸作用的试验。一、基本概念畸形与变异在胚胎或胎儿出现器官形态结构异常称为畸形。机体的形态结构或生理功能，在同一物种的子代与亲代之间或子代的个体之间，有时出现不完全相同的现象，即为变异。一、基本概念二、发育毒性机制1、干扰基因表达5、干扰细胞-细胞交互作用2、基因突变与染色体畸变6、通过胎盘毒性引起发育毒理3损伤细胞和分子水平的翻译7、干扰母体稳态4、细胞凋亡8、内分泌干扰作用三、发育毒性的表现1、生长迟缓。2、致畸作用3、功能不全或异常4、胚胎或胎仔致死作用四、发育毒性三阶段试验五、外源化学物发育毒性的评价传统常规致畸试验动物选择剂量分组动物交配处理胎仔检查结果评定致畸物以及发育毒性作用物危险度评定1、动物选择:致畸试验的动物选择，除参照毒性试验中选择动物的一般原则，即食性和对受试物代谢过程与人类接近，体型小，驯服，容易饲养和繁殖及价廉外，还应特别注意妊娠过程较短、每窝产仔数较多和胎盘构造及厚度与人类接近等特点。2、剂量分组一般应先进行预试，目的是找出引起母体中毒的剂量。最少设3个剂量组，另设对照组。原则上最高剂量组，可以引起母体轻度中毒，即进食量减少、体重减轻、死亡不超过10%。最低剂量组不应观察到任何中毒症状；中间剂量组可以允许母体出现某些极轻微中毒症状。其剂量与高剂量和低剂量成等比级数关系。一般最高剂量不超过LD50的1/5～1/3，低剂量可为1／100～1／30。五、外源化学物发育毒性的评价3、动物交配处理每组动物大鼠或小鼠为12～20只，家兔8～12只，狗等大动物3～4只。将性成熟雌雄动物按雌雄l：1或2：1比例同笼交配。每日将已确定受孕雌鼠随机分入各剂量组和对照组。出现阴栓或精子之日即为受孕0日，也有人作为第1日。由于致畸作用有极为明确的敏感期，应精确掌握动物接触受试物的时间，必须在器官发生期。五、外源化学物发育毒性的评价4、胎仔检查自然分娩前1-2日将受孕动物处死，剖腹取出子宫及活产胎仔，并另行记录死胎及吸收胎。一般大鼠在受孕后第19-20天，小鼠第18-19天，家兔在第29天。下列几方面进行畸形检查：外观畸形肉眼检查，例如露脑；肉眼检查内脏及软组织畸形，例如腭裂；骨骼畸形检查，例如颅顶骨缺损，分叉肋等。畸形检查只限活产胎仔。五、外源化学物发育毒性的评价5、数据处理活产幼仔平均畸形出现数:即根据出现的畸形总数，计算每个活产幼仔出现的畸形平均数。畸形出现率:即作为畸胎的幼仔在活产幼仔总数中所占的百分率。母体畸胎出现率:即出现畸形胎仔的母体在妊娠母体总数中所占的百分率6、结果评定致畸指数越大，致畸作用越强，反之越小。一般认为致畸指数10以下为不致畸，10－100为致畸，100以上为强致畸。母体毒性与发育毒性比值，即母体最低损害作用剂量（A)与胎仔最低损害作用剂量（D)之比，比值越大，危险性越高。五、外源化学物发育毒性的评价7、致畸物以及发育毒性作用物危害度评价欧共体（EEC）和经济合作与发展组织（OECD）建议的致畸物分级标准。主要根据动物试验和人群调查资料，具体分级标准：•1级，已确定人类母体接触后可引起子代先天性缺陷；•2A级，对动物肯定致畸，但对人类致畸作用尚未确定因果关系；•2B级，动物试验结果肯定致畸，但无人类致畸资料；•3级，尚无结论性肯定致畸证据或资料不足；•4级，动物试验阴性，人群中调查结果未发现致畸五、外源化学物发育毒性的评价确定受试物是否具有致畸作用时需注意以下几点：任何结果必须通过统计计算方法进行剂量组与对照组对比；必须具有统计学意义才能认为是阳性结果。应该掌握所用实验动物品系的自然畸形发生率。致畸作用中动物物种和品系差异较为显著，因此要求在两种动物进行试验。由于物种差异，对动物不具有致畸作用的外源化学物对人是否致畸的问题，应格外认真对待。发育毒性的替代试验大鼠全胚胎培养胚胎细胞微团培养小鼠胚胎干细胞试验发育毒性的体内预筛试验(C.K.试验)第四节繁殖试验外源化学物对生殖过程作用的评定主要通过生殖毒性试验来进行，也称为繁殖试验。生殖毒性试验可以全面反映外源化学物对性腺功能、发情周期、交配行为、受孕、妊娠过程、分娩、授乳以及幼仔断乳后生长发育可能发生的影响。评定的主要依据是交配后母体受孕情况（受孕率）、妊娠过程情况（正常妊娠率）、子代动物分娩出生情况（出生存活率）、授乳哺育（哺育成活率）以及断奶后发育情况等。试验方法原则受试动物：性成熟大鼠、小鼠或家兔剂量分组:一般设立三个剂量组（至少两个剂量组）和一个对照组染毒途径:动物接触受试物的方法应参照人类实际接触途径动物数:每组雌雄各16到20只，或雌16到20只，雄8到10只第四节繁殖试验试验方法:三代两窝第四节繁殖试验F３bF３aF１bF２bF２aF１aF０（断奶或出生８周）给予受试物８到１２周第一次交配第二次交配观察三个月，喂饲普通饲料，观察其生长发育情况断乳后给予受试物８到１２周观察三个月，喂饲普通饲料，观察其生长发育情况断乳后给予受试物８到１２周两代一窝(和一代一窝)生殖试验F２断奶，检查发育情况F２出生，每窝留８只幼仔F１交配断奶，给予受试物F１（每窝选留幼仔８只，雌雄各半）第１６~１９周雌雄交配出生第８周给予受试物（F０）第四节繁殖试验观察指标：受孕率（％）:反映雌性动物生育能力以及雌性动物受孕情况正常分娩率（％）:反映雌性动物妊娠过程是否受到影响；幼仔出生存活率（％）:反映雌性动物分娩过程是否正常；幼仔哺育成活率（％）:反映雌性动物授乳哺育幼仔的能力；除上述４个指标外,还应该注意出生幼仔是否有畸形存在，对死亡的幼仔应进行畸形检查，可为下一步致畸试验提供参考。第四节繁殖试验