赋予受体细胞相应抗生素抗性

第三节基因工程简介知识目标：1．简述基因工程的概念2．简述基因操作的三种基本工具的作用3．简述基因工程的原理和基本操作程序4．举例说出基因工程所取得的成果和发展前景•基因工程的基本内容•基因操作的工具•基因操作的基本步骤•基因工程的成果与发展前景•基因工程与医药卫生•基因工程与农牧业、食品工业•基因工程与环境保护新课标：普通高中课程标准实验教科书科技探索之路基础理论和技术的发展催生了基因工程1.1DNA重组技术的基本工具1.2基因工程的基本操作程序拓展视野历史不能忘记中国科学家对PCR的贡献1.3基因工程的应用拓展视野神奇的基因芯片1.4蛋白质工程的崛起选修3现代生物科技专题专题1基因工程基础理论和技术的发展催生了基因工程基因工程理论上三大突破：（1）DNA是遗传物质——1943美Avery肺炎双球菌的转化实验等。（2）DNA双螺旋结构——1953美Watson英CrickDNA双螺旋模型；1958M.Meselson&F.Stahl用实验证明了半保留复制，不同基因具有相同的物质基础。（3）64个密码子破译和中心法则的确立——1958WatsonandCrick提出中心法则，阐明了遗传信息的流动方向，多肽与基因之间存在对应关系。密码形式——使遗传学在分子水平上得到解释，密码子是通用的（3）蛋白组分析蛋白质合成后，还要进行磷酸化、糖基化、除去末端氨基酸、蛋白质剪切等翻译后修饰，仅从核酸的序列并不能完全描述一个蛋白质。尽管分析不同细胞类型中表达的蛋白已近20年，直到1995年才由Wilkins和Williams提出一个与基因组相对应的名词蛋白组分析的核心技术是蛋白质双向电泳。技术上三大发明：（1）基因转移载体的发现——1967，T.F.Roth&D.R.Helinski，发现质粒的自我复制能力，并能够在细菌之间转移。基因是可以转移的。（2）工具酶的发明——1972H.C.Smith、W.Arber&D.Nathans从流感嗜血杆菌中分离得到限制性内切酶；1970年，逆转录酶的发现使真核细胞的基因制备成为可能；此后，多种限制酶和连接酶发现。基因是可切割的。（3）DNA体外重组的实现——1972年，美Berg第一次构建出了体外重组DNA分子。重组DNA表达实验的成功——1973，H.Boyer&S.Cohen选用仅含单一EcoRI酶切位点的载体质粒pSC101，使之与非洲爪蟾核糖体蛋白基因的DNA片段重组。重组的DNA转入大肠杆菌DNA中，转录出相应的mRNA。基因工程诞生元年H.Boyer&S.Cohen技术进一步推动基因工程的发展：（1）第一例转基因动物和转基因植物问世——1980科学家通过显微注射培育出世界第一个转基因小鼠。1983，科学家采用农杆菌转化法，培育出世界上第一例转基因烟草。（2）PCR技术的发明——1988年，美K.Mullis发明PCR技术，使基因工程进一步发展。TheNobelPrizeinChemistry1993forhisinventionofthepolymerasechainreaction(PCR)methodKaryB.MullisLaJolla,CA,USA4．基因工程的发展历史1）1972年美国Berg,Jackson等人将基因工程的发展历史1）1972年美国Berg,Jackson等人将猿猴病基因组SV40DNA,噬菌体基因，大肠杆菌半乳糖操纵子，体外重组获得成功。2）1973年美国斯坦福大学Cohen,Boyer等，在体外构建含有四环素，链霉素两个抗性基因的重组质粒分子,导入大肠杆菌后稳定复制，赋予受体细胞相应抗生素抗性。------（宣告基因工程诞生）3）1978年美国Genentech公司利用重组大肠杆菌合成人胰島素的先进生产工艺----（揭开基因工程产业化的序幕）4）1983年，携带有细菌新霉素抗性基因的重组Ti质粒转化植物细胞获得成功-------（高等植物转基因技术问世）5）1990年，美国科学家对一名因腺苷脱氨酶基因缺陷患有重度联合免疫缺陷症的儿童进行基因治疗获得成功。-------（分子医学新纪元）6）1991年，美国倡导在全球实施人类基因组计划，用15年时间斥资30亿美元，完成12万5000个人类基因的全部测序工作。7）1997年，英国科学家利用体细胞克隆技术复制出“多利”绵羊。-------（人类可以在实验室进行复制自身的尝试）2005年，邓宏魁，丁明孝教授克隆小白鼠在中国属首例。遗传工程（基因工程）研究的意义（1）说明两种能力A.基因工程，它超越生物种属界限,具有跨越天然物种屏障的能力.B.把来自任何一种生物的基因，放置在与其毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞中的能力。（2）表明一种创造性应用这一技术，有可能按照人们的主观愿望，创造出自然界中原先并不存在的新的生物类型。（3）简化生物物种进化程序，加快生物物种进化速度.（4）强调了一种事实：确定的DNA小片段在新寄主细胞中进行扩增的事实—可以制备到大量纯化的DNA片段.（5）从而拓宽了分子生物学的研究领域。“工欲善其事，必先利其器”DNA重组技术的基本工具限制性内切酶——基因的剪刀DNA连接酶——基因的针线运载体——基因的运输工具1.限制性内切酶(RestrictionEndonuclease)概念l存在于任何一种原核细菌中.l识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并在合适的反应条件下，使位点上催化双链DNA分子的磷酸二酯键断裂,切割产生5’-P、3’-OH分子,切割成两种末端：平端和粘端l各种生物呈现特征性的限制性内切酶酶切图谱.——识别特定序列l在生物分类,基因定位,基因重组,疾病诊断,刑事侦察领域极为重要HamiltonSmith,DanielNathans(USA)andWernerArber(Switzerland)－－1978NobelprizeTheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1978forthediscoveryofrestrictionenzymesandtheirapplicationtoproblemsofmoleculargenetics限制性内切酶的发现：(宿主细胞的限制和修饰作用)限制：细菌的自我保护系统病毒的侵染修饰：修饰系统－防止自杀（1）两种不同来源的入-噬菌体入K，入B；（2）能高频感染各自大肠杆菌宿主细胞K株，B株（3）当它们分别与其它宿主菌交叉混合培养时，感染下降数千倍。（4）一但入K噬菌体在B株成功，由B株繁殖出入K后代，能感染B株,不能感染原来K株.限制性内切酶对抗外来DNA细菌细胞病毒病毒DNA限制性内切酶病毒注入DNA分子限制性内切酶切割入侵的DNA切割修饰酶EcoRI修饰酶加甲基特点1）识别序列：4，5或6个碱基对EcoRI识别5’-G/AATTC-3’序列3’-CTTAA/G-5’2）180度旋转对称回文结构，对称轴在第三，四碱基之间。3）任何一个DNA分子，每9对碱基出现一个II类酶切口。限制性内切酶及其缓冲液2.DNA连接酶（DNAligase）DNA双链分子上相邻3’羟基和5’磷酸基团共价结合，形成3’-5’磷酸二酯键，使原来断开的缺口重新连接起来。DNA片断怎么连起来？3.运载体载体的三大功能：1）为外源基因提供进入受体细胞的转移能力。2）为外源基因提供在受体细胞的的复制能力或整合力。3）为外源基因提供在受体细胞的的扩增和表达能力。用什么方法将目的基因送入细胞？假如目的基因导入受体细胞后不能复制将怎样“分子运输车”应该具备什么特点？理想载体具备四个条件：1)具有对受体细胞的可转移性，提高导入细胞的效率。——对受体细胞无害、易分离。2)具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点，使外源基因在受体细胞中稳定遗传。——能自我复制3)具有多种单一的限制性内切酶识别切割位点，有利于外源基因的拼接插入——有切割位点4)具有合适的选择标记（报告基因），便于DNA重组分子的检测。——有遗传标记基因4.36(kb)大肠杆菌源质粒；含复制起始位点，能在大肠杆菌中高拷贝复制；含氨卞青霉素抗性基因（Ampr）和四环素抗性基因（Tetr）选择标记基因，对重组子进行筛选；含多个限制性内切酶酶切位点；克隆载体；载体有两个抗药性基因，插入失活一个抗药性基因，而在另一个基因筛选标记存活的是转化子，在插入失活的基因筛选标记中不存活的是转化子。质粒的构建与改造1)删除不必要的DNA区域，缩小分子量，提高外源DNA片段装载量。2)灭活某些质粒的编码基因。3)加入易于识别的选择标记基因。4）选择标记基因内引入内切酶的识别及酶切位点的序列——多克隆接头(Polylinker)。5)加入特殊的基因表达调控元件。实验：模拟重组DNA入-双链噬菌体由头部外壳蛋白和48.5kb双链DNA组成，入-DNA两端各有一个12碱基组成互补单链,称cos末端，cos末端将DNA引入头部，噬菌体的头部空壳蛋白对入–DNA的包装与其序列无关,只识别COS位点。固体平板培养基出现透明斑点（噬菌斑）.液体培养液由混浊变澄清，说明大肠杆菌完全被裂解。噬菌斑是经过若干裂解周期形成宿主菌死亡区域。提取目的基因目的基因与运载体结合将目的基因导入受体细胞目的基因的检测和表达基因工程的基本操作程序基因工程的基本过程1)切用限制性内切酶切开外源基因和载体分子。2）接用连接酶将外源基因连接到载体分子上。3）转借助细胞转化将DNA重组分子导入细胞。4）增培养转化细胞，扩增DNA重组分子。5）检筛选和鉴定转化细胞及目的基因。鸟枪法(Shotgun)将某种生物体的全基因组或单一染色体切成大小适宜的片段，分别连接到载体上，转化受体细胞，形成一套重组克隆，筛选出含有目的基因期望重组子。鸟枪法局限性：如同盲人打鸟而得名，工作量很大，克隆含有目的基因的片段。90%真核生物中目的基因中含有内含子，真核生物中目的基因不能在原核细菌中表达。（1）目的基因组DNA片段的制备。如：机械切割，用超声波处理，采用合适强度和时间。切割的DNA片段控制一定大小范围内，上限是载体最大装载量，下限应大于目的基因长度。（2）外源DNA片段的全克隆。选质粒或DNA作为载体。受体细胞选大肠杆菌。（3）期望重组子的筛选。菌落，菌斑原位杂交法，外源基因产物功能检测法。（4）目的基因的定位。在已知克隆的DNA片段上准确定位目的基因后，进行序列测定。提取目的基因cDNA法：cDNA文库（cDNABank）cDNA是与mRNA互补的DNA(ComplementaryDNA)，将供体生物细胞的mRNA分离出来，利用逆转录酶在体外合成cDNA，克隆在受体细胞内，筛选获得含有目的基因编码序列的重组克隆。优点：（1）能选择性克隆蛋白编码基因，由mRNA反转录合成cDNA对特的基因而言只有一种可能性。（2）cDNA法克隆基因相当“纯净”，不含5’端调控区，剔除内含子结构，有利于原核细胞的表达。（3）比相应的基因组拷贝要小数十倍，2-3Kb或更小，便于稳定地克隆在表达型质粒上。•发明PCR，公司奖励10,000美元奖金•专利卖给Hoffmann-LaRoche公司卖了3亿美元•Mullis得了1993年诺贝尔化学奖利用PCR技术扩增目的基因PCR扩增上亿个拷贝（几个小时），而癌症细胞以高复制能力而著称，完成同样的多制工作一个癌症细胞需要整整一个月。化学合成法：前提a.如果目的基因的全序列是已知的，用化学合成法直接合成。b.DNA自动合成仪可合成不超过50个碱基寡聚核苷酸单链。c.用于核酸杂交的探针，分子克隆的人工接头，PCR扩增的引物。d.由单链寡聚核苷酸通过退火直接装备双链DNA片段或基因。基因文库，理论上它含有某一生物染色体的所有DNA片段，包括基因编码区和间隔区DNA。由鸟枪法和cDNA法构建。鸟枪法构建的为基因组文库(GenomicBank)。cDNA文库,含有生物体的全套蛋白质编码序列,不含DNA调控序列从cDNA文库筛选蛋白质编码基因，比从基因文库筛选要简捷。目的基因与运载体的结合——表达载体的构建•目的基因•启动子和终止子•标记基因•核糖体结