2015药典无菌检查(常州培训)

12015药典-无菌检查江苏省医疗器械检验所2020年5月•12主要内容1.无菌产品理念2.无菌和无菌检查法概念3.无菌操作及无菌技术要求4.无菌检查法的局限性5.医疗器具无菌检验依据6.实验环境条件及人员要求7.试验主要设备8.培养基种类用途及配制要求9.培养基适用性检查10.方法适用性试验11.供试品的无菌检查2020年5月•21、无菌产品理念灭菌产品的无菌保证不能依赖最终产品的无菌检验，它是作为确定批无菌产品是否无菌的一个检验项目，而产品的无菌保证要取决于生产过程中采用合格的灭菌工艺、良好的无菌保证体系和严格的GMP管理。2020年5月3•34无菌：是指某一物体或某一环境中不含有活的微生物。无菌检查法：用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。2、无菌和无菌检查法概念2020年5月•43、无菌操作及无菌技术要求无菌操作是指在无菌环境条件下，在对无菌制品或无菌器械等进行检验的过程中，能防止微生物污染与干扰的一种常规操作方法。无菌技术是指在微生物试验工作中，控制或防止各类微生物的污染及其他干扰的一系列操作方法和有关措施，无菌试验器材及无菌操作。2020年5月5•54、无菌检查法的局限性若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。2020年5月6•675、医疗器具无菌检验依据本规范选用于《中国药典》2015年版四部1101无菌检查法。GB/T14233.2-2005《医用输液、输血、注射器具检验方法，第二部分：生物试验方法中规定的无菌试验方法。2020年5月•786、实验环境条件要求2015药典无菌检查：应在无菌条件下进行，试验环境必须达到无菌检查的要求，检验全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止微生物污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。隔离系统按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。2020年5月•86.1实验环境洁净度要求（修改）2020年5月9•9106.2实验环境人员要求：菌检人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术培训。2020年5月•10117、试验主要设备细菌培养箱霉菌培养箱超净工作台可调温的培养箱显微镜台式高压蒸汽灭菌器立式高压蒸汽灭菌器电热恒温干燥箱集菌仪2020年5月•1112试验仪器（1）-超净工作台2020年5月•1213试验设备（2）--隔水式恒温培养箱2020年5月•1314试验设备（3）----霉菌培养箱2020年5月•1415试验设备（4）-立式高压蒸汽灭菌器2020年5月•1516试验设备（5）--台式蒸汽灭菌器2020年5月•1617试验设备（6）--显微镜2020年5月•1718试验设备（7）-生物安全柜2020年5月•1819试验设备（8）Equinox全自动无菌检验系统2020年5月•19208、培养基种类及用途硫乙醇酸盐流体基（主要用于厌气菌培养、也可用于需氧菌培养）胰酪大豆胨液体基（用于真菌和需氧菌培养）2020年5月•20218.1培养基配制及要求培养基的灭菌：配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。保存时间：制备好的培养基应保存在：2～25℃、避光环境。非密闭容器中：一般在三周内使用；密闭容器中：一般可在一年内使用。2020年5月•21228.2培养基配制及要求硫乙醇酸盐培养基：配制后调节PH值为弱碱性，使灭菌后在25℃的pH为7.1±0.2，分装在适宜的容器中，其装量与容器高度的比列应符合培养后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度1/2。灭菌。在供试品接种前，培养基的氧化层（粉红色）的高度不得超过培养基深度的1／5，否则，须经100℃水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟），迅速冷却，只限加热一次，并防止被污染。硫乙醇酸盐培养基：置30～35℃培养。2020年5月•22238.3培养基配制及要求胰酪大豆胨液体基：取培养基成分混合，微温溶解，滤过，调节PH值约为7.3±0.2，加入葡萄糖，摇匀，分装，灭菌。胰酪大豆胨液体基：置20～25℃培养。2020年5月•23248.4培养基配制及要求培养基装量：对于采用直接接种法检查的供试品，应根据供试品接种量确定培养基的装量，每个容器中培养基的用量应符合接种的供试品体积不大于培养基体积的10%。供试品检查时，培养基的用量和高度同方法适用性试验。2020年5月•24259、培养基适用性检查无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基等应符合培养基的无菌检查及灵敏度检查的要求。无菌性检查：每批培养基随机取不少于5支（瓶），置培养基规定的温度培养14天，应无菌生长。灵敏度检查：用于培养基灵敏度检查所用的菌株传代不得超过5代（从菌种保存中心获得的干燥菌种为0代），采用适宜的方法保存；并以保证试验菌株的生物学特性。2020年5月•25269.1培养基适用性检查菌种：试验用菌株及菌液制备：①金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003②铜绿色假单胞菌[CMCC(B)10104]③枯草杆菌[CMCC(B)63501]④生孢梭菌[CMCC(B)64941]⑤白色念珠菌[CMCC(F)98001]⑥黑曲霉[CMCC(F)98003]2020年5月•26272020年5月注：10倍梯度稀释；选择适宜的3个稀释级别；要求＜100cfu/ml。•27289.2培养基适用性检查菌液制备接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体基中或胰酪大豆胨琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30～35℃培养18～24h；接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中或沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20～25℃培养24～48h，上述培养物用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌量小于100cfu菌悬液；接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，20～25℃培养5～7天，加入3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管中，用含0.05%（V/V）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数小于100cfu孢子悬液；（如表9.3）注：菌悬液在室温下2h使用,若保存在2～8℃可在24小时内使用。2020年5月•28299.3培养基灵敏度检查菌种接种培养基培养温度℃培养时间金黄色葡萄球菌新鲜培养物至胰酪大豆胨液体基或胰酪大豆胨琼脂基上30～3518～24h铜绿假单孢菌枯草芽孢杆菌生孢梭菌新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中白色念珠菌新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基上20～2524～48h黑曲霉新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上20～255～7d2020年5月培养基灵敏度检查使用6株菌见下表•29309.4培养基适用性检查培养基接种金黄色葡萄球菌2支硫乙醇酸盐流体培养基铜绿假单胞菌2支12ml（7支）生孢梭菌2支空白对照1支分别接种小于100cfu金黄色葡萄球菌、铜绿假单孢菌、生孢梭菌菌悬液各2支,另1支不接种作为空白对照,培养3天，逐日观察结果。2020年5月•30319.5培养基适用性检查培养基接种枯草芽孢杆菌2支胰酪大豆胨液体基白色念株菌2支9ml（7支）黑曲霉2支空白对照1支每分别接种小于100cfu枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各2支,另1支不接种作为空白对照,培养5天，逐日观察结果。2020年5月•31329.6培养基适用性检查结果判断空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管试验菌生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定。2020年5月•323310.方法适用性试验试验目的:1)进行无菌检查时，应进行方法适应性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的无菌检查；2)若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，应重新进行方法适用性试验；3)方法适用性试验按“供试品的无菌检查”的规定及下列要求进行操作。对每一试验菌应逐一进行方法确认。2020年5月•333410.1方法适用性试验菌种及菌液制备：除大肠埃希菌（Escherichiacoli）[CMCC(B)44102〕外，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉同培养基灵敏度检查。注：大肠埃希菌的菌液制备同金黄色葡萄球菌。2020年5月•3410.2方法适用性试验薄膜过滤法直接接种法取每种培养基规定接种的供试品总量按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入小于100cfu试验菌，过滤。加硫乙醇酸盐流体培养基或胰酪大豆胨液体培养基至滤筒内。另取一装同体积培养基的容器，加入等量试验菌，作为对照。置规定温度培养3～5天。各试验菌同法操作。取符合直接接种法培养基用量要求的硫乙醇酸盐流体培养基6管，分别接入小于l00cfu的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌各2管；取符合直接接种法培养基用量要求的胰酪大豆胨液体基6管，分别接入小于l00cfu的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各2管。其中1管接入规定量的供试品，另1管作为对照，按规定的温度培养3～5天。•352020年5月3610.3方法适用性试验结果判断与对照管比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，则说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，照此检查法和检验条件进行供试品的无菌检查。如含供试品的任一容器中试验菌生长微弱、缓慢或不生长，则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用。可采用：1)增加冲洗量，或增加培养基的用量；2)使用中和剂，或更换滤膜品种等方法，消除供试品的抑菌作用，并重新进行方法适用性试验。注：方法适用性试验也可与供试品的无菌检查同时进行。•362020年5月11、供试品的无菌检查1.无菌检查法包括薄膜过滤法和直接接种法。1.供试品无菌检查所采用的检查和检验条件应与方法适用性试验确认的方法相同。2.无菌试验过程中，若需试验表面活性剂、中和剂，应证明其有效性，且对微生物无毒性。37•372020年5月11.1供试品无菌检查检验数量：检验量：检验数量是指一次试验所用供试品最小包装容器的数量。是指供试品每个最小包装接种至每份培养基的最小量（g或ml）。•382020年5月11.2供试品的无菌检查无抑菌作用及抗革兰氏阳性为主的供试品以金黄色葡萄球菌为对照菌；抗革兰氏阴性菌为主的供试品以大肠埃希菌为对照菌;抗厌氧菌的供试品以生孢梭菌为对照菌；抗真菌的供试品以白色念珠菌为对照菌。阳性对照试验的菌液制备同方法适用性试验，加菌量小于100cfu,供试品用量同供试品无菌检查时每份培养基接种的样品量。阳性对照管培养48～72小时应生长良好。阳性对照应根据供试品特性选择阳性对照菌：•392020年5月11.3供试品的无菌检查阴性对照：供试品无菌检查时，应取相应溶剂和稀释液、冲洗液同法操作，作为阴性对照；阴性对照不得有菌生长。2020年5月40•404111.4供试品的无菌检查薄膜过滤法：薄膜过滤法应采用封闭式薄膜过滤器。无菌检查用的滤膜孔径应不大于0.45μm，直径约为50mm。根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥，为发挥滤膜最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试品经薄膜过滤后，若需要冲洗液冲洗滤膜。每张滤膜每次冲洗量为100ml.,且总冲洗量不得超过1000ml，以避免滤膜上的微生物受损伤。2020年5月•4111.5供试品的无菌检查水溶性供试品：取规定量，直接过滤，或混合至含不少于100ml适宜稀释的无菌容器中，混匀，立即过滤。如供试品具有抑菌作用，须用冲洗液冲洗滤膜。冲洗次数不少于三次，所用的冲洗量、冲洗方法同方