不同模式死亡细胞对巨噬细胞分泌炎性细胞因子的调节作用

南方医科大学硕士学位论文不同模式死亡细胞对巨噬细胞分泌炎性细胞因子的调节作用姓名：刘璇申请学位级别：硕士专业：免疫学指导教师：孙尔维20090410://://://://://://://://://://://://://://://://://://://://://://://://://://://://://不同模式死亡细胞对巨噬细胞分泌炎性细胞因子的调节作用作者：刘璇学位授予单位：南方医科大学相似文献(10条)1.期刊论文陆朝阳.姜洪池.潘尚哈.孙备.孟庆辉.谭宏涛.孙学英供体凋亡/坏死细胞对大鼠脾移植急性排斥反应的作用研究-中华肝胆外科杂志2008,14(1)目的探讨供体凋亡与坏死细胞对大鼠脾移植急性排斥反应的作用及机制.方法建立大鼠异位脾移植模型后,随机分为4组:A组输注生理盐水2ml;B组输注供者凋亡细胞5×106;C组输注正常供体细胞悬液5×106;D组输注5×106坏死细胞.术后不同时间点每组取大鼠8只进行指标测定.结果移植后脾出现排斥反应并逐渐加重,D组最为严重,A组和C组次之,B组最为轻微.各组移植脾匀浆和受体血清中IFN-γ水平逐步增加,为B组低于A组,而D组高于A组,A组与C组相似.B组大鼠移植脾匀浆和血清中TGF-β水平明显升高,其他各组TGF-β1水平持续于较低水平.凋亡细胞抑制混合淋巴细胞反应,而坏死细胞则作用相反.结论供体细胞能够影响大鼠脾移植急性排斥反应,可能与细胞因子偏移和受体同种免疫反应性改变有关.2.学位论文顾冬生自身凋亡/坏死细胞对体内调节性T细胞的影响2009凋亡（apoptosis）和坏死（necrosis）是细胞的两种主要死亡方式。细胞凋亡又称程序化死亡，是生物体内普遍存在的生理和病理现象，其特点是细胞主动的、程序化的和耗能的死亡，表现为核固缩、细胞皱缩、磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）外翻、凋亡小体形成，同时凋亡细胞或凋亡小体在体内被迅速清除，不引起炎症反应。坏死是细胞受到化学、物理或者生物等外界环境因素的伤害而引起非程序化的、被动的和破坏性的细胞死亡过程，其表现为细胞能量代谢中止，细胞膜通透性增高，细胞肿胀或破裂、细胞核固缩或碎裂，内容物释放到周围组织中去，引起炎症反应。近年来研究发现，凋亡细胞在体内不仅仅是被清除，而且还会释放或者促进吞噬细胞释放大量的“抗炎性因子”，激活一系列信号途径，最终下调免疫反应，诱导免疫耐受。目前，已经证实，凋亡细胞在自身免疫、肿瘤免疫、感染免疫以及移植免疫等过程中均发挥重要的作用。凋亡细胞吞噬障碍可以引起自身免疫病，而肿瘤的发生发展也与凋亡异常有关，供体凋亡细胞还能够诱导啮齿类动物的移植免疫耐受。但是，目前对于凋亡细胞诱导免疫耐受在机制还不是很清楚。与凋亡细胞不同的是，坏死细胞可以启动免疫应答反应。坏死细胞在体内被吞噬后，可以促进树突状细胞的活化（dendriticcell，DC）；坏死细胞与巨噬细胞（macrophage，M（））共培养后，可以提高巨噬细胞的抗肿瘤能力，坏死细胞同时可以刺激M（）分泌大量炎性因子。此外，坏死细胞本身也会释放“危险信号”，活化固有免疫，启动免疫反应。凋亡和坏死同为细胞死亡方式，对免疫系统的影响却如此不同，这也引起了普遍关注。凋亡和坏死两者之间到底有什么样的联系，目前还未有定论。就当前研究进展来看，调节性T细胞（regulatoryTcell，Treg）在凋亡诱导的免疫耐受中起着非常重要的作用。Treg是一组具有抑制其它免疫细胞功能的免疫调节细胞，现已被证明在各种不同免疫反应的调节过程中都不可或缺。有实验证实静脉输注凋亡细胞可以升高Treg，而去除Treg后，凋亡细胞将不能诱导免疫耐受。此外，Treg的产生和增长都依赖转化生长因子β（transforminggrowthfactorβ，TGF-β），而凋亡细胞被吞噬后恰好会产生大量的TGF-β。然而，坏死细胞与Treg的关系目前还不清楚。凋亡细胞诱导免疫耐受的作用现在被相当多的免疫学研究者寄望于解决移植排斥问题，但是目前仅仅在啮齿类动物上有良好的进展。在大动物尤其是非人灵长类动物上，还未有突破。关键在于目前对凋亡/坏死作用于免疫系统的很多机制没搞清楚。Treg的发现和凋亡细胞诱导免疫耐受研究的进展，无疑是对原有免疫学“克隆选择学说”理论的重大挑战。显然，进一步在灵长类动物上研究凋亡细胞和Treg的关系，将有利于探讨凋亡细胞诱导免疫耐受的临床研究；而同时研究坏死细胞和Treg的影响，则有助于理解不同方式死亡的细胞对免疫耐受和免疫应答平衡的不同调节作用，并掌握不同死亡细胞调节免疫的关键细胞和关键分子，从而为临床上有效地调控免疫反应提供思路。目的：1.研究诱导恒河猴外周血单个核细胞凋亡的方法；2.观察凋亡细胞联合雷帕霉素对恒河猴体内Treg的影响；3.研究坏死细胞对小鼠体内Treg的作用，以及H2O2处理后的坏死细胞对Treg的影响。方法：1.抽取恒河猴静脉血，梯度密度分离法分离外周血单个核细胞。采用紫外线照射法诱导凋亡，摸索不同照射时间、不同孵育时间以及是否照射时增加震荡等诱导凋亡的条件。细胞凋亡率的判断使用异硫氰荧光素（fluoresceinisothiocyannate，FITC）标记的钙磷脂结合蛋白V（AnnexinV）和碘化丙啶（propidiumiodide，PI）染色，流式细胞仪检测。2.四只恒河猴分为两组，实验组每天给予口服0.4mg雷帕霉素，并静脉输注凋亡细胞一次，细胞数目约3.5×107个；对照组每天给予同样剂量雷帕霉素，并注射PBS一次。定期检测各组恒河猴外周血中CD4+Foxp3+Treg，并计算Treg占CD4+T细胞的比例。对比两组恒河猴Treg变化曲线的异同。3.将36只6周龄SPF级Balb/C小鼠随机分为四组。第一组为坏死细胞组（n=10），尾静脉注射2×107个（200μl）未经任何处理的坏死细胞；第二组为H2O2处理坏死细胞组（n=10），尾静脉注射50mMH2O2处理后的坏死细胞2×107个；第三组为PBS+H2O2对照组（n=10），尾静脉注射含50mMH2O2的PBS200μl；第四组为空白对照组（n=6），不做任何处理。2周后处死小鼠，检测外周血、脾脏、胸腺中CD4+Foxp3+Treg，并计算Treg占CD4+T细胞的比例。统计学分析采用SPSS16.0软件进行单向方差分析，分别比较各组间外周血、脾脏和胸腺中的Treg比例和Treg占CD4+T细胞的比例有无差异，所有数据以均数±标准差（X±SD）表示。（1）坏死细胞的制备5周龄SPF级Balb/C小鼠3只，处死后迅速取出胸腺研磨，PBS洗涤制备细胞悬液并计数。调整细胞浓度后56℃水浴1小时。坏死率判断使用AnnexinVFITC和PI染色，流式细胞仪检测。（2）调节性T细胞检测采用美国eBioscience公司推荐的Treg检测方法，抗小鼠CD4单克隆抗体标记后，eBioscience公司专用打孔/固定液处理细胞，每份样本再分为两管，一管加入抗小鼠Foxp3单克隆抗体，另一管加入同型对照IgG2b。4℃避光孵育1小时后流式细胞仪检测。结果：1.紫外线（UVC）照射法诱导恒河猴外周血单个核细胞凋亡。采用RPMI1640培养基加10%小牛血清重悬细胞，紫外线20cm距离照射1小时，同时震荡细胞，然后孵育15小时可获得满意凋亡率。总凋亡率在95%以上。2.凋亡细胞联合雷帕霉素升高恒河猴体内CD4+Foxp3+Treg占CD4+T细胞的比例。单纯口服雷帕霉素的两只恒河猴，Treg/CD4+T比例在一只猴未见有明显增加，在第38天为6.92%，另一只仅在4周后明显增加，在第38天为13.7%；而注射凋亡细胞联合雷帕霉素组的两只恒河猴，其Treg/CD4+T的比例在输注凋亡细胞后大约2-3周即有明显增加，两只猴在第38天Treg/CD4+T细胞比例升至16.67%和21.56%。3.坏死细胞处理后小鼠CD4+Foxp3+Treg的比例。应用不同的处理方法处理小鼠后两周，检测小鼠不同淋巴组织中的小鼠CD4+Foxp3+Treg占淋巴细胞比例。结果发现：在脾脏中，空白对照组为（3.80±0.24）%，PBS+H2O2对照组为（3.41±0.64）%，坏死细胞组为（2.75±0.38）%。坏死细胞组与空白对照组和PBS+H2O2对照组相比显著降低（F=6.895，Pvs空白=0.000，PvsPBS+H2O2=0.004）。而H2O2处理坏死细胞组为（3.42±0.49）%，与坏死细胞组相比显著增高（F=6.895，P=0.004），但与空白对照和PBS+H2O2对照组相比无显著差异（F=6.895，Pvs空白=0.139，PvsPBS+H2O2=0.948）。表明H2O2处理后的坏死细胞消除了后者降低CD4+Foxp3+Treg的作用。在外周血和胸腺中，均未见各组间有统计学差异（Fblood=0.337，Pblood=0.799；Fthymus=0.507，Pthymus=0.680）。CD4+T细胞占淋巴细胞比例：在小鼠外周血、脾脏、胸腺中，各组CD4+T细胞占淋巴细胞比例未见统计学差异。然后我们观察了CD4+Foxp3+Treg占CD4+T细胞比例：外周血中，空白对照组为（7.09±1.93）%，PBS+H2O2对照组为（8.46±2.48）%，坏死细胞组为（6.19±1.62）%，H2O2处理坏死细胞组为（6.34±1.05）%。空白对照组与PBS+H2O2对照组无统计学差异（F=2.887，P=0.166）。坏死细胞组与H2O2处理坏死细胞组相比PBS+H2O2对照组均有显著降低（F=2.887，P坏死=0.013，PH2O2+坏死=0.020）。在脾脏，空白对照组为（16.74±1.54）%，PBS+H2O2对照组为（14.16±3.27）%，坏死细胞组为（10.15±2.64）%，坏死细胞组与空白对照组或PBS+H2O2对照组相比均显著降低（F=8.482；Pvs空白=0.000，PvsPBS+H2O2=0.002）；H2O2处理坏死细胞组为（12.81±2.44）%，比坏死细胞组有增高（F=8.482，P=0.043），但仍低于空白对照组水平（F=8.482，P=0.007）。在胸腺未见各组间具有统计学差异（