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江西科技师范大学生物工程综合实训题目：ELISA法测定辣椒粉中的苏丹红Ⅰ含量院（系）：生命科学学院班级：2011级生物工程1班学生姓名：李标学号：20111764指导老师：裘雪梅2014年7月5日1ELISA法测定辣椒粉中的苏丹红Ⅰ含量摘要：本实验是采用ELISA方法测定辣椒粉中的苏丹红Ⅰ含量。实验通过对苏丹红Ⅰ进行修饰，与载体蛋白交联得到免疫抗原和包被抗原并用牛奶封闭，在酶标二抗的连接下加入底物显色液，用2mol/L的H2SO4终止，并测定其OD450值，得到最佳实验结果为：当抗原浓度为2ug/ml，抗体浓度为1:32000时效果最佳。并用此修饰的苏丹红Ⅰ对样品辣椒粉进行测定其苏丹红Ⅰ含量。关键词：ELISA；苏丹红Ⅰ；辣椒粉Abstract:ThisexperimentwasmeasuredbyELISASudanⅠcontentinthechilipowder.ExperimentalmodifiedbySudanⅠobtainedwithacarrierproteincross-linkingtotheimmunizingantigenandenvelopeantigenandblockedwithmilk,thechromogenicsubstratesolutionisaddedtotheunderHRPresistanceconnectionterminationwith2mol/LH2SO4,andmeasuringOD450values,thebestexperimentalresultsasfollows:Whentheconcentrationofantigen2ug/ml,antibodyconcentrationof1:32000whenthebestresults.SudanⅠandmodifiedsamplechilipowderDeterminationofSudanⅠcontent.KeyWord:ELISA；sudanI；chilipowder引言“苏丹红”是一种化学染色剂，并非食品添加剂，主要应用于诸如油彩、汽油、地板蜡等化工产品的着色，也用于鞋、地板等的增光。苏丹红I的化学名称为1-苯基偶氮-2-萘酚，是一种遗传毒性致癌物质，能引起实验动物肝脏、膀肤细胞癌变，对人体健康有害并可能致癌。2002年研究人员发现它们能造成人类肝脏细胞的DNA突变，显现出可能致癌的特性。苏丹红I还具有遗传毒性和致敏性，可引起人体皮炎。苏丹红I的代谢产物是苯胺和1-氨基-2萘酚，其中胺在体内外均具有遗传毒性，国际癌症研究机构(InternationalAgencyforResearchonCancer，IARC)研究报告将苏丹红I归为三类致癌物。全球多数国家都禁止将其用于食品生产。自1995年起，我国及欧盟和其他一些国家已开始禁止在食品中添加苏丹红I。目前检测苏丹红的方法主要有：高效液相色谱法、液质联用法和气质联用法。上述方法需要大型仪器，检测成本高，并且因为食品种类繁多，基体复杂，对实验条件要求苛刻，因此建立一种简捷测定苏丹红染料的分析方法，并应用于食品检验具有重要意义。酶联免疫吸附测定法(ELISA）采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。灵敏度可达10-9，ELISA方法还有价廉、简便的特点，它已经广泛应用2于食品检测领域中。本实验就是用LISA方法测定辣椒粉中苏丹红Ⅰ号含量。1试剂与仪器1.1主要试剂1μg/ml抗原，奶粉，1×PBS，10×PBS，吐温-20，1:1000一抗，4mg/mL抗原，1:3000酶标二抗，底物显色液（底液A+TMB），2mol/LH2SO4，洗液，辣椒粉，纯甲醇，200ng/mL苏丹红Ⅰ，标准样品等。10×PBS配制：0.1MpH7.4、80gNaCl、29gNa2HPO4·12H2O、2gKH2PO4、2gKCl蒸馏水定容至1000Ml。A液：柠檬酸1.05g、乙二胺四乙酸·二钠（EDTA－2Na）0.18g、超纯水定容至300mL，加溶有0.25gTMB、200mL丙酮。B液：冰乙酸钠2.45g过氧化脲0.5g冰乙酸3mL加蒸馏水定容至500mL，配置显示液时A＋B1:1。1.2主要仪器可拆卸酶标板、移液枪（100μL、50μL）、量筒、烧杯、电子天平、微波炉、排枪、恒温培养箱等、酶标仪。其他材料：卫生纸，脱脂奶粉，卫生纸2实验方法2.1包被与封闭(1)配制准备液：①1×PBS制备：将10×PBS溶液稀释10倍②抗原的制备：用4mg/mL抗原和1×PBS配制1ug/mL、2ug/mL、4ug/mL的抗原。③质量体积5%牛奶的制备：取15g奶粉配成300mL牛奶溶液。④洗液的制备：取0.5mL的吐温-20用1×PBS配成1000mL溶液(2)取酶标板3排24孔（8×3）。(3)加100uL抗原，纵列1ug/mL，纵列2ug/mL，纵列4ug/mL(4)37℃温育2h。(5)2h后，弃液，用洗液洗板1次(6)加质量体积5%牛奶，满孔，封闭(7)37℃，封闭40min，弃液，洗板4次2.2方阵滴定32.2.1加一抗用1×PBS缓冲溶液作空白对照，将1:1000浓度的抗体用1×PBS缓冲溶液梯度稀释，具体为1：1000；1：2000；1∶4000；1∶8000；1∶16000；1∶32000；1∶64000；1∶128000，37℃，温育30min后，洗板4次。结果如下表1：表1方阵滴定浓度123A1:1000B1:2000C1:4000D1:8000E1:16000F1:32000G1:64000H1×PBS2.2.2加酶标二抗二抗可以与一抗结合，酶标二抗是在二抗的基础上连接辣根过氧化（HRP），将酶标二抗加入洗板后的酶标板中，100μL/孔，37℃恒温培养，40min后，洗板4次。2.2.3加底物显色液用底物A液和B液配置成底物显色液，酶标板每空加100μL，，37℃恒温培养，10min后取出，保留溶液。2.2.4终止每孔加50μL2mol/L的H2SO4终止反应，溶液呈黄色，测OD450值。在酶标仪上测定OD450的值，比较各组数据，找出反应的最适抗原、抗体浓度。2.3标准曲线的建立2.4样品的提取取2g辣椒粉加30mL60%甲醇水（苏丹红Ⅰ溶浓于有机溶剂）。超声波或搅拌30min，离心8000rpm，10min。取上清液，过滤，上清液2ml加2ml水稀释。2.5检测样品中的苏丹红Ⅰ(1)取酶标板16孔（8×2），各孔加入100uL2ug/mL的抗原，4℃过夜包被。纵列抗体浓度横排4(2)取100mL100%甲醇加200mL蒸馏水配制成30%的甲醇水。(3)第二天，弃液，洗板1次。(4)配置质量体积为5%的牛奶，(5)用质量体积5%的牛奶封闭酶标板40min，弃液，洗板4次，(6)加标准品及抗体（见下表）①每孔加50uL35%甲醇至右排第4孔，第一孔加入200ng/mL标准品50ul，倍比稀释至右排第2孔。②PBS对照：100uL1×PBS③阳性对照：100uL1:2000的抗体④50uL样品1、样品2⑤每孔加入50uL1:1000的抗体（除阴阳对照）加标准品及抗体后试剂浓度如下表2：表2加标准品及抗体后试剂浓度12A0ng/ml样品B0.05ng/ml样品1C0.10ng/ml样品2D0.25ng/ml样品3E0.50ng/ml样品4F1.00ng/ml样品5G2.50ng/ml阳性对照H5.00ng/ml阴性对照(7)37℃恒温箱中放40min，弃液，洗板4次(8)各孔加入1：32000酶标二抗100uL，37℃中恒温箱中放40min，弃液，洗板4次。(9)各孔加入显色液100uL，10min，保留液体(10)10min后，加50uL2mol/mLH2SO4，终止反应(11)在酶标仪上测定OD450的值3、结果纵列样品浓度横排53.1方阵滴定测定表3方阵滴定测得的OD450抗体稀释度1（1ug/mL抗原）2（2ug/mL抗原）3（4ug/mL抗原）1:10001:20001:40001:80001:160001:320001:640001×PBS2.6862.4492.0161.5521.0550.6880.4470.0882.8362.6682.3732.3631.7210.9280.5050.0892.8762.8282.5702.4901.8511.1860.6150.114由表3结果可知，当抗原包被浓度为2ug/mL，抗体使用浓度为1：32000时测定的OD值最接近于1.0。则本次方阵滴定实验找出的最佳浓度即为此浓度。由于实验操作的不稳定性大，重复性小，则取最佳抗原包被浓度2ug/mL，抗体使用浓度1：32000。3.2标准曲线在酶标仪中测得的OD450如下表4测得的OD450纵列12ABCDEFGH0.5800.5480.5040.3480.2800.2230.1320.0850.3880.4260.3630.3880.4480.4100.6120.265根据实验检测的结果有SudanⅠ零浓度标准品溶液的OD450为0.838，即B0为0.838。6再取标准品浓度分别为0.05ng/mL、0.10ng/mL、0.25ng/mL、0.50ng/mL、1.0ng/mL、2.50ng/mL、对应的OD450值分别为0.747、0.645、0.570、0.359、0.354、0.241进行标准曲线的绘制。结合率为B/Bo，根据以上数据求得标准品浓度0.05ng/mL的B/Bo%为(0.838)×100=89.1，同理求得其他数据的结合率为87.9、68.0、54.8、42.8、由以上数据即可作出如下图所示的SudanⅠ标准曲线，见表5。表5标准曲线的横、纵坐标横坐标5×10-²10×10-²25×10-²50×10-²100×10-²纵坐标89.187.968.054.842.8得到的标准曲线如下：图1苏丹红Ⅰ的标准曲线图3.3测定结果根据标准曲线y＝－12.132ln﹙x﹚﹢81.488，将两个样品所得OD450值–PBS的OD450值所得结果代入公式得，即可求出样品中苏丹红Ⅰ含量，结果见表6.表6样品中苏丹红Ⅰ含量样品OD450样品浓度(ng/mL)样品0.3880.103样品10.4260.06样品20.3630.142样品30.3880.103样品40.4880.47样品50.4100.0774讨论本实验用ELISA法检测辣椒粉中的苏丹红Ⅰ含量，该方法特异性强、灵敏度高、重现性好、测定方便，其他荧光物质、色素、结构类似物对检测无干扰并且一次可同时测定多份样品，有较好的前景。