ELISA的概念、原理、操作步骤

ELISA的概念、原理、操作步骤ELISA是酶联接免疫吸附剂测定(Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay)的简称。它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。(一)原理ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。即:用于检测抗体的间接法(图a)、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。(二)操作步骤方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法:1.包被：用0.05MPH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。2.加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。方法二用于检测未知抗体的间接法：用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml，37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。(三)试剂器材1.试剂(1)包被缓冲液(PH9.60.05M碳酸盐缓冲液):NaCO31.59克NaHCO32.93克加蒸馏水至1000ml(2)洗涤缓冲液(PH7.4PBS)：0.15MKH2PO40.2克Na2HPO4·12H2O2.9克NaCl8.0克KCl0.2克Tween-200.05％0.5ml加蒸馏水至1000ml(3)稀释液:牛血清白蛋白(BSA)0.1克加洗涤缓冲液至100ml或以羊血清、兔血清等血清与洗涤液配成5～10％使用。(4)终止液(2MH2SO4）：蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸(98％)21.7ml。(5)底物缓冲液(PH5.0磷酸棗柠檬酸):0.2MNa2HPO4(28.4克／L)25.7ml0.1M柠檬酸(19.2克／L)24.3ml加蒸馏水50ml。(6)TMB(四甲基联苯胺)使用液:TMB(10mg／5ml无水乙醇)0.5ml底物缓冲液(PH5.5)10ml0.75％H2O232μl(7)ABTS使用液:ABTS0.5mg底物缓冲液(PH5.5)1ml3％H2O22μl(8)抗原、抗体和酶标记抗体。(9)正常人血清和阳性对照血清。2.器材:(1)聚苯乙烯塑料板(简称酶标板)40孔或96孔，ELISA检测仪，50μl及100μl加样器，塑料滴头，小毛巾，洗涤瓶。(2)小烧杯、玻璃棒、试管、吸管和量筒等。(3)4℃冰箱，37℃孵育箱。(四)注意事项1.正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。2.在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括:(1)固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。（2)包被抗体(或抗原)的选择：将抗体(或抗原)吸附在固相载体表面时，要求纯度要好,吸附时一般要求PH在9.0～9.6之间。吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采用4℃18～24小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度(0.1、1.0和10μg／ml等)进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的OD值。选择OD值最大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1～10μg／ml。(3)酶标记抗体工作浓度的选择：首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定(见酶标记抗体部份)。然后再固定其它条件或采取“方阵法”(包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度)在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。(4)酶的底物及供氢体的选择：对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应，而本身无色。有些供氢体(如OPD等)有潜在的致癌作用，应注意防护。有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体，如TMB和ABTS是目前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间，以10-30分钟为宜。底物使用液必须新鲜配制，尤其是H2O2在临用前加入。一、实验目的1.深入了解ELISA法测定抗体效价的原理。2.掌握ELISA法测定单克隆抗体效价的方法。二、实验原理ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。免疫酶技术是将酶标记在抗体/抗原分子上，形成酶标抗体/酶标抗原，称为酶结合物。该酶结合物的酶在免疫反应后，作用于底物使之呈色，根据颜色的有无和深浅，定位或定量抗原/抗体。ELISA法是免疫酶技术的一种，其特点是利用聚苯乙烯微量反应板(或球)吸附抗原/抗体，使之固相化，免疫反应和酶促反应都在其中进行。在每次反应后都要反复洗涤，这既保证了反应的定量关系，也避免了末反应的游离抗体/抗原的分离步骤。在ELISA法中．酶促反应只进行一次，而抗原、抗体的免疫反应可进行一次或数次，即可用二抗(抗抗体)、三抗再次进行免疫反应。目前常用的几种ELISA方法有：测定抗体的间接法，测定抗原的双抗体夹心法和测定抗原的竞争法等。本实验采用间接法测定单克隆抗体效价。其主要过程为：首先将已知定量抗原吸附在聚苯乙烯微量反应板的凹孔内，加待测抗体，保温后洗涤以除去未结合的杂蛋白质，加酶标抗抗体，保温后洗涤，加底物保温30分钟后，加酸或碱终止酶促反应，用目测或光电比色测定抗体含量。三、仪器、原料和试剂仪器聚苯乙烯96孔酶标板、微量移液管、酶联免疫阅读仪、水浴锅。原料单克隆抗体试剂1.抗原及酶标记抗体①抗原：兔抗人IgG(RabbitAanti-humanIgG，CodeNo．A0423)；②酶标抗抗体：兔抗鼠IgG-HRP(RabbitAnti-mouseIgG-HRP，CodeNo．P0260)；均为DAKO公司产品，使用时按照说明书要求稀释。4.洗涤液(含0.05％Tween20的PBS)：1LPBS中加入Tween-20500μL。5.封闭液(含1％牛血清白蛋白，0.1％Tween20的PBS)：10mLPBS中加入100mgBSA，10μLTween-20。6.底物溶液①磷酸钠盐缓冲液(0.1mol/LpH6.0)：称Na2HPO4·12H2O2.2g，NaH2PO4·2H2O6.84g，用蒸馏水溶解，定容至500mL。②TMB贮液：称60mgTMB溶于10mL二甲基亚砜中，4℃避光保存。③底物应用液：现用现配，磷酸钠缓冲液10mL，TNB贮液10μL。30％H2O215μL，混匀。7.终止液：2mol/LH2SO4四、操作步骤①抗原包被：兔抗人IgG作为抗原，用包被液l：8000稀释，100μL/孔加入聚苯乙烯96孔反应板中。4℃放置过夜。②洗涤：次日倾去凹孔内的液体，洗涤液洗3次。③封闭：加l00μL/孔封闭液，室温放置0.5h。④洗涤：用洗涤液洗3次。⑤加待测样品(一抗)：将含单克降抗体的细胞培养上清在另—块板上用PBS连续稀释(按照1：2或1：10)，100μL/孔加到已包被的板上，每个样品平行做两份，PBS或空白培养基作为阴性对照，已知样品作为阳性对照。加盖37℃恒温箱温育1~2h。⑥洗涤：用洗涤液洗3次。⑦加酶标抗抗体：兔抗鼠IgG-HRP，用封闭液l：8000稀释，100μL／孔，加盖37℃恒温箱温育1h。⑧洗涤：用洗涤液洗5次，蒸馏水洗2次。⑨显色：加新鲜配制的底物溶液100μL/孔，室温暗处放置5～30min，显示蓝色。⑩终止反应、比色：加50μL/孔终止液．颜色变黄；用酶标仪测定450nm处各孔的吸光值，阳性反应的最大稀释度为待测样品的效价。