病毒纯化密度梯度离心法

病毒纯化，即应用各种物理、化学方法，以不使病毒受损伤和失活为前提，去除宿主细胞组分等非病毒杂质，提取出高纯度浓缩的病毒样品。病毒提纯是病毒学研究的重要前提，病毒微细形态结构的研究、病毒抗原蛋白的分离提纯、病毒化学成分及其遗传物质－DNA或RNA的详细研究都需要高纯度的病毒样品。病毒纯度只是一个相对的概念，很难有绝对的标准，通常以下几点可以作为判定依据。物理均一性：测定病毒样品的物理均一性，是证明其纯度的常用方法，包括电镜检查、病毒粒子沉降系数和扩散常数及其在凝胶电泳、等电聚焦中的迁移率等。病毒滴度与蛋白含量的比例：测定病毒材料的感染力或其血清学反应、滴度与其蛋白含量的比例，也是一种通常采用的纯度测定方法。病毒滴度对蛋白含量的比例越高，说明病毒的纯度越高。免疫学反应：免疫反应单一而无非特意反应，则说明病毒材料比较纯净。结晶形成：病毒粒子在十分纯净的情况下，经常可以形成结晶，但少数混有杂质的病毒样品亦可形成结晶，所以这也只是一个相对标准。病毒纯化方法:1超速离心法，其中的平衡梯度密度离心是常用的方法，在该溶液里加入少量大分子溶液，则溶液内比溶剂密度大的部分就产生大分子沉降，比溶剂密度小的部分就会上浮，最后在重力和浮力平衡的位置，集聚形成大分子带状物。因为病毒颗粒跟其他生物分子大小不一样，所以病毒在梯度离心过程中形成独特的条带，从而达到分离纯化的效果。但此法对仪器的要求很高，转速至少30000rpm/min，在这个转速下要求离心时间7-8小时。2现在开发出各种亲和树脂，能有效地吸附病毒粒子，从而达到病毒纯化的目的。Biomiga公司所开发的病毒纯化系列试剂盒，采用新型材料，能有效吸附腺病毒、腺相关病毒、慢病毒等，加入适当浓度的离子溶液将病毒粒子解离回收，最后对病毒进行脱盐处理，所得病毒纯度高，整个操作简便，极大地缩短了纯化时间，针对需要纯化大量病毒的客户提供大量提取试剂盒，满足客户不同需要。密度梯度离心法英文名称：densitygradientcentrifugationmethod〔1〕亦称平衡密度梯度离心法。用超离心机对小分子物质溶液，长时间加一个离心力场达到沉降平衡，在沉降池内从液面到底部出现一定的密度梯度。若在该溶液里加入少量大分子溶液，则溶液内比溶剂密度大的部分就产生大分子沉降，比溶剂密度小的部分就会上浮，最后在重力和浮力平衡的位置，集聚形成大分子带状物。利用这种现象，测定核酸或蛋白质等的浮游密度，或根据其差别进行分析的一种沉降平衡法。自1958年米西尔逊（M．Meselson），斯塔尔（F．W．Stahl），维诺格拉德（J．Vinograd）成功地分离了〔15N〕DNA和〔14N〕DNA以来，该法取得许多成果。为得到必要的浓度梯度，多采用浓氯化铯溶液，所以有时也使用氯化铯浓度梯度离心法这个名称，还可采用氯化铷、溴化铯等溶液。通常利用分析超离心机，但在将细胞颗粒成分进行分离等以纯化为目的的情况，利用密度差，使用分离超离心机，采用预先制备好的蔗糖等的密度梯度。〔2〕采用蔗糖等一些小分子溶液，预先在分离超离心机的样品地内制备出密度梯度，在其上面再加上一层少量的大分子溶液后，离心，大分子就形成层状而沉降。若含有沉降系数不同的许多成分，就会出现许多层。这种情况采用适当的编排号码，取出样品池内的溶液，然后进行研究。这是与〔1〕不同的一种沉降速度法，除了以相同的目的被用于通常的沉降速度法外，在能取出分离物这点上是有优越性的。因多采用蔗糖密度梯度，所以亦称为蔗糖密度梯度离心法。按同样原理，也可使用分析超离心机进行测定。工作原理又称速率—区带离心,沉降系数较接近的物质分离的方法；原理：不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。介质梯度应预先形成，介质的最大密度要小于所有样品颗粒的密度。常用的有蔗糖、甘油；密度梯度液的制备用梯度混合器，形成由管口到管底逐步升高的密度梯度。主要应用可用来分离核酸、蛋白质、核糖体亚基及其它成分。操作纯化病毒常用的方法是蔗糖密度梯度离心法，能得到比较纯的病毒。其过程如下：1、将收集的组织或脏器或其他,用玻璃匀浆器充分研磨后制成悬液,经反复冻融3次后,置-20℃冰箱中,备用。2、先以5000g离心15分钟后，获取上清夜，然后再20000g高速离心30分钟后取上清夜。3、接着10万g超速离心2h，将沉淀用少量STE溶解。4、先在超速离心管中加入5-8mL的第3步所获取的含病毒样品的溶解液，然后在离心管中依次加入30%,45%,60%的蔗糖,加的时候是用长针头从底部往上加的。11万g离心2.5h,发现在30%与45%以及45%与60%之间都有一条明亮的带，用长针头将两条不同部位的带都吸取出来，分别收集到不同的瓶内。5、去蔗糖；用STE缓冲液适量稀释纯化的病毒，然后11万g离心3h,用少量STE（根据沉淀的量决定加入多少）缓冲液把沉淀悬起，即最后获得了纯化的病毒。-20度冻纯备用，用时可用分光光度计测定其病毒含量。注意事项离心前将样品小心铺放在密度梯度溶液表面，离心形成区带。离心后不同大小、不同形状、有一定沉降系数差异的颗粒在密度梯度液中形成若干条界面清楚的不连续区带。再通过虹吸、穿刺或切割离心管的方法将不同区带中的颗粒分开收集，得到所需的物质。1、梯度介质应具备足够大的溶解度，以形成所需的密度梯度范围。2、梯度介质不会与样品中的组分发生反应。3、梯度介质也不会引起样品中组分的凝集、变性或失活。4、若离心时间过长由于颗粒的扩散作用，会使区带越来越宽。为此，应适当增大离心力、缩短离心时间，可以减少由于扩散而导致的区带扩宽现象。STE缓冲液（Sodium-Tris-EDTA，STE）10mmol/LTris-Cl(pH8.0)0.1mol/LNaCl1mmol/LEDTA(pH8.0)在15psi(1.05kg/cm2)高压下蒸汽灭菌15min。将灭菌溶液与4°C保存。猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）为动脉炎病毒科动脉炎病毒属的成员，病毒粒子呈球型，直径为55～60纳米，是一种有囊膜的单股正链RNA病毒。基因组为单分子线状正链单股RNA，大小为13000-15000nt，具有5，端帽及3，端聚A尾。该病毒在一种动物传代细胞（恒河猴胚胎肾上皮细胞Marc-145）上培养后，反复冻融细胞使病毒从细胞中释放出来后，通过超速离心纯化病毒。我们可以提供纯化的病毒液和提取的病毒总RNA。