生物制药工艺学考试重点

第一章绪论生物药物：利用生物体、生物组织或其成分、综合应用多学科（生物学与医学﹑生物化学与分子生物学﹑微生物学与免疫学﹑物理化学与工程学和药学）的原理和方法进行加工、制造而成的用于预防﹑诊断﹑治疗疾病的药物。现代生物药物四大类型：1、天然生物药物，来自动植物、微生物和海洋生物的天然产物，包括天然生化药物，微生物药物，海洋药物；2、合成与部分合成的生物药物；3、基因重组多肽，蛋白类治疗剂；4、基因药物，以DNA,RNA为基础的基因治疗剂、基因疫苗,反义药物和核酶等。后两类为新生物技术药物。生物药物的性质1、化学构成上，生物药物接近于体内的正常生理物质,更易为机体所吸收利用和参与人体的正常代谢与调节。2、药理学上,生物药物具有更高的生化机制合理性和特异治疗有效性。3、医疗上，生物药物具有药理活性高、针对性强、毒性低、副作用小、疗效可靠及营养价值高等特点。4、生物药物的有效成分在生物材料中浓度都很低,杂质的含量相对较高。5、生物药物常常是一些生物大分子。它们不仅分子量大,组成、结构复杂,而且具有严格空间构象,以维持其特定的生理功能。6、生物药物对热、酸、碱、重金属及pH变化较敏感，各种理化因素的变化易对生物活性产生影响。生物药物的分类1、天然生物药物2、基因工程药物3、基因药物4、生物制品第二章生物制药工艺技术基础组织与细胞的破碎1）机械破碎：组织捣碎、匀浆器破碎、研磨器破碎2）物理破碎：超声波、渗透压、温差3）化学破碎：溶剂处理、表面活性剂处理4）酶学破碎：自溶法、加酶法细胞器的分离：差速离心法某些与细胞结构结合牢固的生物大分子，在提取时采用高浓度盐溶液（如4mol/L盐酸胍，8mol/L脲或其他变性剂，这种方法称“盐解”）。P15盐析、等电点沉淀（了解）生化活性物质的分离与纯化1）沉淀法：盐析、等电点沉淀、有机溶剂沉淀2）膜分离：透析（脱盐）、超滤3）层析：吸附、离子交换、凝胶(分子筛)、亲和4）电泳法：分离和纯度鉴定5）离心：差速离心、密度梯度离心、等密度离心第三章氨基酸的生产方法1.水解法：包括酸水解、碱水解、酶水解；是最早发展起来的方法；以毛发、血粉及废蚕丝等蛋白质原料，通过酸、碱或酶水解成多种氨基酸混合物，经分离纯化获得各种药用氨基酸的方法，称水解法。水解法生产氨基酸的主要过程为水解,分离,结晶精制。2.发酵法：氨基酸发酵属于好氧的不完全发酵方法利用微生物具有能够合成自身所需各种氨基酸的能力，通过对菌株的处理，选育出各种缺陷型及抗性的变异菌株，以解除代谢调节中的反馈与阻遏，达到过量合成某种氨基酸的目的。原料丰富、成本低，产物均为L-氨基酸；产物浓度低，分离复杂。3.酶转化法利用酶催化底物生产氨基酸的方法。利用化学合成法制得的廉价中间体，借助酶的生物催化作用，使氨基酸具有工业生产的可能。应用此法批量生产的氨基酸有赖氨酸、L-胱氨酸。4.化学合成法有机合成及化学工程相结合的技术生产氨基酸的方法。化学合成法可以生产目前已知的所有氨基酸，含有D和L两种旋光异构体（手性异构体），因此多数不具备工业价值。仅限于甘氨酸、蛋氨酸和色氨酸。其中，甘氨酸是应用化学合成法生产的最理想品种。DL混合型蛋氨酸及色氨酸能为畜禽利用，也具有一定价值。各种水解法的比较名称水解条件优点缺点应用酸水解用6～10mol/LHCl在110～120°C下，水解12～24h水解完全彻底，全部是L－氨基酸，不引起氨基酸消旋作用色氨酸全被破坏；丝氨酸、酪氨酸部分破坏；腐蚀设备；劳动条件差；产生大量废酸工业生产常采用碱水解用6mol/LNaOH在100°C水解6h水解完全，色氨酸不被破坏，不腐蚀设备氨基酸发生消旋作用；丝氨酸、精氨酸、苏氨酸、胱氨酸等大部分被破坏一般很少采用酶水解用胰酶或胰浆、微生物蛋白酶等，在适宜的PH、温度、一定的时间和酶浓度下水解蛋白质反应条件温和；氨基酸不被破坏；不发生消旋作用；设备简单；劳动条件较好水解不彻底；中间产物多肽类较多；一般时间较长；易污染菌用于制造蛋白胨、水解蛋白、氨基酸生产较少用氨基酸的具体制备工艺PH调到2.5：注意氨基酸的等电点与带正负电荷的关系，利用离子交换，将各种氨基酸沉淀和分离。赖氨酸的制备工艺（部分相关）育种途径高丝氨酸缺陷型抗赖氨酸结构类似物（AECR）抗苏氨酸结构类似物（AHVR酶拆分法：制备L-苯丙氨酸原理与过程DL-Phe与醋酸酐反应生成Ac-DL-Phe，氨基酰化酶可专一性水解Ac-L-Phe的酰胺键生成L-Phe，而不水解Ac-D-Phe酰胺键，再利用L-Phe与Ac-D-Phe在水中的溶解度的差异进行分离，Ac-D-Phe又可经消旋生成Ac-DL-Phe，再进行水解和分离。如此反复进行，可将DL-Phe全部转化为L-Phe。氨基酸输液定义：多种结晶L-氨基酸依特定比例混合制成的静脉内输注液称氨基酸输液。氨基酸输液的组成与要求1.所有氨基酸均为L-型。2.必须含有8种必需氨基酸和两种半必需氨基酸。3.必需氨基酸和非必需氨基酸应按一定比例。4.有些氨基酸输液还需要加入山梨醇、木糖醇、维生素、无机离子等，以补充能量，提高营养价值和氨基酸利用率。加入醇的原因：提高氨基酸的利用率；加速伤口愈合；防止氨基酸反应产生热源性物质；平衡C/N比。第四章多肽与蛋白质的区别蛋白质具有复杂的空间结构：是由一条或两条以上肽链（多肽）组成的生物大分子，是多肽链折叠，盘曲形成的一定空间结构，其决定了蛋白质具有生物活性的功能。胸腺激素以胸腺为原料，按一定方法提取纯化的具有生物活性的物质。组分5，在80℃热稳定的由40～50种多肽组成的混合物，MW为1，000～15，000。pI3.5～9.5。分三个区域：α区，β区，γ区。其中，主要活性组分为α1、α5、α7、β3、β4等。生理功能：连续诱导T细胞分化发育的各个阶段，放大并增强成熟T细胞对抗原或其他刺激物的反应，维持机体的免疫平衡状态。组分5的制备盐析：第一次取上清液；第二次取盐析物。活力测定：E-玫瑰花结升高百分数不得低于10%。（T细胞CD2分子与绵羊红细胞产生E-玫瑰花结）。干扰素定义：干扰素：由病毒和其他种类的干扰素诱导剂，刺激网状内皮系统（人体免疫系统的一种）、巨噬细胞、淋巴细胞及体细胞所产生的糖蛋白。作用：具有抗增殖、免疫调节、抗病毒和诱导分化作用。干扰素的相对分子质量小，对热稳定-20℃可长期保存其活性pH2~10范围内干扰素不被破坏人体能产生天然干扰素，经一定的制剂加工过程也能制造药物-干扰素制剂。干扰素不能直接灭活病毒，通过诱导细胞合成抗病毒蛋白发挥效应。分类：干扰素按抗原性不同分α、β和γ三类，Le干扰素即α-干扰素（IFN－α），F干扰素β干扰素（IFN－β），T-干扰素即γ干扰素（IFN－γ）。根据氨基酸序列差异，同一型分为若干亚型，如α1、α2、α3……同一亚型内因氨基酸的差异而细分，如α2有三种：α2a、α2b、α2c天然干扰素通过分别刺激淋巴母细胞和人体白细胞，然后提纯制备而得。工艺①分离灰黄层：取得白细胞和红细胞②NH4Cl处理，低渗处理，抗凝剂溶解残存的红细胞。③启动诱生，加入人α-IFN④正式诱生，加入仙台病毒(在鸡胚中培养）⑤收获，将培养物离心，上清液即为粗制α–IFN⑥纯化胰岛素生理作用：机体内唯一降低血糖的蛋白质类激素，也是唯一同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成的激素。药理作用：治疗糖尿病、消耗性疾病。其他功能：促进钾离子和镁离子穿过细胞膜；促进脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)及三磷酸腺苷(ATP)的合成。来源：胰脏β-细胞制造胰岛素，α-细胞制造胰高血糖素和胰抗脂肝素，δ-细胞制造生长激素抑制因子。结构：胰岛素由A、B两条肽链组成，外加二硫键。A7(Cys)-B7(Cys)、A20(Cys)-B19(Cys)四个半胱氨酸中的巯基形成两个二硫键，使A、B两链连接。A链中A6(Cys)与A11(Cys)之间也存在一个二硫键。稳定性：胰岛素在弱酸性水溶液或混悬在中性缓冲液中较为稳定。水溶液中胰岛素分子受pH、温度、离子强度的影响产生聚合和解聚。PH2时，是单体；能够结合锌成为一个二聚体；PH升高，聚合度上升；PH升到4-7时，溶解度下降，无定型沉淀；PH7，为六聚体；PH9，解聚成无活性的单体。工艺精制依据：易溶于稀酸、稀碱，和80%以下的乙醇；90%的乙醇会产生干扰，导致其难溶。第五章酶类药物酶类药物的分类1．促消化酶类：水解和消化食物中的成分，如蛋白质，糖类和脂类等。复合消化剂2．消炎酶类：溶菌酶、菠萝蛋白酶、胰凝乳蛋白酶3．溶血纤维蛋白酶类：防止血小板凝集，阻止血纤维蛋白形成或促进其溶解。主要有链激酶、尿激酶、纤溶酶、凝血酶等。4．抗肿瘤酶：天门冬酰胺酶（水解天冬酰胺）5．其它：青霉素酶分解青霉素，治疗青霉素引起的过敏反应；超氧化物歧化酶抗氧化、抗幅射、抗衰老。酶类药物的要求（1）在生理pH（中性）下具有高活性和稳定性；（2）对基质亲和力高，用量少。（3）血清中半衰期较长（4）无免疫原性或较低（5）无需外源的辅助因子（6）纯度高（尤其注射用酶）酶类药物的提取和纯化（1）生物材料的预处理：机械处理、反复冻融、丙酮粉法、干燥法、超声波法、酶解法（2）提取：水溶液、有机溶剂、表面活性剂（3）纯化：酶比活、总活力回收胃蛋白酶：广泛存在于哺乳类动物的胃液中，药用胃蛋白酶系从猪、牛、羊等家畜的胃液粘膜中提取。PI1.0，最适pH1.5～2.0，最适温度37-40℃。多种蛋白水解酶的混合物，含有胃蛋白酶、组织蛋白酶、胶原酶等，为粗制的酶制剂。外观为淡黄色粉末，有肉类特殊气味及微酸味。水解大多数天然蛋白质，对两个相邻芳香族氨基酸（苯丙、酪、色）构成的肽键最敏感。蛋白质水解不彻底，产物有胨、肽和氨基酸的混合物。工艺路线：结晶胃蛋白酶的制备：药用胃蛋白酶原粉，20%乙醇溶解，调pH3.0，5℃静置20h后过滤，硫酸镁盐析。盐析物乙醇溶解,过滤，滤液用硫酸调pH至1.8～2.0，析出针状胃蛋白酶。针状沉淀溶于pH4.0的20%乙醇，过滤，调pH1.8，得针状结晶。酶活测定见课本(p101)胰蛋白酶：从牛、羊、猪胰脏提取、结晶的冻干制剂，易溶于水，pI10.1。在酸溶液中稳定，在碱溶液中加热则变性沉淀。Ca2+有保护和激活作用。牛胰蛋白酶原有229个氨基酸，含6对二硫键，在肠激酶或自身催化下，释放出6肽，变成有活性的胰蛋白酶胰蛋白酶专一作用于由碱性氨基酸精氨酸及亮氨酸羧基所组成的肽键。胰蛋白酶属丝氨酸蛋白水解酶。酶本身很容易自溶，降解为拟胰蛋白酶，乃至碎片，活力逐渐下降或丧失。胰蛋白酶很容易自溶的原因：生产工艺尿激酶：碱性蛋白酶，由肾脏产生，主要存在于人及哺乳动物的尿中，具有溶解血栓的作用溶菌酶：小分子碱性蛋白，在机体中起非特异防御机制，是有效的抗菌剂，水解细菌细胞壁的肽聚糖来溶菌。L-天门冬酰胺酶：最适pH8.5，专一地催化天冬酰胺水解形成L-天门冬氨酸和氨主要用于治疗白血病。超氧化物歧化酶（SOD）：重要的氧自由基清除剂，催化超氧阴离子自由基歧化为H2O2和O2，属金属酶第六章核酸类药物核酸类药物：具有药用价值的核酸、核苷酸、核苷、碱基及其衍生物核酸类药物的分类具有天然结构的核酸类物质：ATP、GTP、CTP、UTP、肌苷自然结构核酸类物质的类似物和聚合物：叠氮胸苷、阿糖腺苷、阿糖胞苷等ATP：用于心肌炎、心肌梗死、心力衰竭及动脉或冠状动脉硬化的治疗或辅助治疗。肌苷：用于急慢性肝炎、肝硬化、白细胞减少、血小板减少等。高尿酸血症：尿酸盐结晶沉积于关节、软组织、软骨及肾，导致关节炎、尿路结石和肾脏疾病。治疗：别嘌呤醇核酸类药物的生产方法(p113)：直接提取法水解法（酶水解、碱水解、酸水解）（课本p113）化学合成法酶合成法微生物发酵法核酸类药物的制备RNA的提取与制备:1,RNA的工业来源2,高RNA含量酵母菌体的筛选:酵母菌体收率高，易于提取RNA。从自然界筛选并用诱变育种提高酵母的RNA含量3,稀碱法:用氢氧化钠溶液，使细胞壁