外周血单个核细胞总RNA的分离纯化及其逆转录

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外周血单个核细胞总RNA的分离纯化及其逆转录实验内容人外周血单个核细胞总RNA的分离和纯化。逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。外周血单个核细胞分离的原理•人外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC)包括淋巴细胞和单核细胞。•单核细胞的体积、形态和比重与外周血其他细胞不同,因此利用一种介于1.075-1.090之间的聚蔗糖-泛影葡胺(ficoll-hypaque)分离液作密度梯度离心,离心后不同比重的血细胞在分离液中呈梯度分布,从而分离出PBMC。外周血单个核细胞的分离实验步骤1.吸取2ml淋巴细胞分离液加入5ml塑料试管;2.取抗凝血1ml,用1ml生理盐水稀释混匀,然后沿管壁缓慢加入到淋巴分离液(上层为抗凝血,下层为淋巴细胞分离液);3.2500rpm,离心15min(沉降系数不同,而分离出单核细胞);4.吸弃最上层血浆,再吸取单核细胞层至一新的5ml塑料试管中,加生理盐水至管口1cm处,混匀后离心,2500rpm,5min;5.吸弃上清,加生理盐水500ml轻柔吹打混匀后,转入1.5mlEp管中,2500rpm,5min;6.吸弃上清,留细胞沉淀于Ep管中于下一步总RNA的提取。酸性酚法抽提RNA的原理苯酚在酸性条件下既可溶解DNA,又是蛋白变性剂,联用氯仿可使细胞裂解以及蛋白质与RNA分离,最后利用异丙醇沉淀核酸,获的纯化的总RNA。RNA极易降解,因其RNA酶分布广、活性强、且难以失活,痕量的RNA酶就能够造成严重的RNA降解,实验中采用多种措施抑制RNA酶的活性,减少RNA的降解。1.焦磷酸二乙酯(DEPC),一种强烈的烷化剂,能够和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而以抑制外源RNA酶。2.异硫氰酸胍,一种强蛋白变性剂,可使包括RNA酶在内的所有酶活性丧失,抑制外源性RNA酶活性。抑制RNA酶活性的试剂注意事项——预防RNase污染1.人的唾液中含有大量RNase,皮肤中含有RNase和细菌,而霉菌有可能成为RNase来源。2.要使用灭菌的RNA专用的塑料制品,避免交叉污染。3.RNA在Trizol中不会被RNase污染,我们要注意后续的实验中要使用不含有RNase的塑料制品和玻璃器皿。单核细胞中总RNA提取实验步骤1.在上述Ep管中加入500ul变性液(Trizol:苯酚+异硫氰酸胍)悬浮细胞,加100ul氯仿,强烈震荡或置漩涡混合器上混匀,冰浴10min。2.4℃,12000rpm,离心10min。吸取上层无色水相(含有RNA)转入新的1.5mlEp管中,加入等体积异丙醇,-20℃,15min。3.4℃,12000rpm,离心10min。去上清,加入500ul70%乙醇(不吹打!)4℃,12000rpm,离心10min,去上清,烘干。4.加10ulDEPC(焦磷酸二乙酯)水溶解RNA。逆转录-PCR的原理提取组织或细胞中的总RNA,以其中的mRNA作为模板,采用Oligo(dT)或随机引物,利用逆转录酶特异性地反转录成cDNA,再以cDNA为模板进行PCR扩增,而获得目的基因。转录产物具有连续的氨基酸编码区,不需要进行剪接,可在原核细胞中表达。完整的逆转录反应体系除需要逆转录酶,适当的反应缓冲液,RNA模板,逆转录酶及四种脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)外,还需加入RNase抑制剂。本实验利用人外周单个核细胞中RNA逆转录成cDNA,然后再以此cDNA为模板,利用特异性引物,通过PCR选择性扩增细胞因子的cDNA序列。实验步骤——逆转录逆转录反应体系:MgSO42ml2×bcastBuffer5mldNTP0.5mlRNasin0.5mlRandomprimer0.5ml样品总RNA1.5ml总体积10ml反应条件:65oc1min30oc5min30oc-65oc15min--30min(匀速升温)98oc5min5oc5min实验步骤——PCR扩增反应体系:10×Buffer2mlMg2+1.5mldNTP2mlcDNA5mlTaq0.2mlprimer2mlddH2O17.3ml总体积30ml反应条件:94℃5min94℃45s56℃30s72℃30s72℃5min4℃保存×30c结果与分析PCR产物进行琼脂糖电泳鉴定,标明目的条带,非目的条带。具体实验结果分析,如果实验失败,请分析原因,按实际实验出发。

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