显微镜的发展与应用

显微镜的发展与应用宋昊林王伟邹雨航张海人的眼睛不能直接观察到比0.1mm更小的物体或物质的结构细节。人要想看到更小的物质结构，就必须利用放大结构。很早以前，人们就知道某些光学装置能够放大物体。比如在《墨经》就有记载能放大物体的凹面镜。公元前一世纪，人们就发现通过球形透明物体去观察微小物体时，可以使其放大成像。凸透镜——有时人们称它为“放大镜”。单个凸透镜能够将物体放大几十倍，这远远不足以让我们看清某些物体的细节。十六世纪的显微科学•早在1590年，荷兰和意大利的眼镜制造者已经造出类似显微镜的放大仪器。•1590年荷兰眼镜制造商詹森父子制作了第一台复式显微镜，其基本原理就是两个凸透镜，一个凸透镜把另外一个所成的像进一步放大，并把它们放进了一个圆筒中。尽管其放大倍数只有十几倍，但具有划时代的意义。十七世纪的显微科学•1654年荷兰人列文虎克制成了第一台能将物体图像放大270倍的简易显微镜，超过了以往任何一种显微镜。他一生中制作了200多台显微镜和500多个镜头。当列文虎克把他的显微镜对准一滴雨水的时候，他惊奇的发现了其中令人惊叹的小小世界：无数的微生物游曳其中。他是第一个看到活细胞的人，观察过原生动物、人类精子、鲑鱼的红细胞、牙垢中的细菌等等。与之同时代的显微镜滑杆显微镜弹簧显微镜伽利略的显微镜胡克的显微镜十八世纪的显微科学•十八世纪是欧洲科学复苏的时期,各种新的科学理论层出不穷。但显微镜发展较慢,主要着重于外观和机械装置的改善，制作出了一些漂亮的复式显微镜。•它们的共同特点:几乎所有的显微镜的基座都连在一个木盒子上。十八世纪中使用最广泛的显微镜:卡夫(CUFF)显微镜•英国显微镜设计师JohnCuff在17世纪中叶设计了一种新型的显微镜。这种显微镜很快得到了人们的喜爱。在以后的很多年里这种显微镜被大量地制造和使用(甚至在当时的一些解剖学著作里都可以看到对这种显微镜的介绍)，同时又被不断地改造和完善。它们被统称为Cuff显微镜。•卡夫显微镜的特色在于:(1)新式底座。(2)独特镜臂结构。(3)当时最先进的聚光方法。•Chest显微镜Cuff-Style显微镜Wales显微镜•马丁显微镜历史上最豪华的显微镜:英王GeorgeIII的银显微镜。十九世纪的显微科学•到了十九世纪，随着工业革命的进行，显微科学也同其它学科一起飞速发展起来。其主要的原因是机械的使用使透镜的质量大大提高和光学的发展使显微镜的结构更加符合光学原理。•在十九世纪中叶还出现了显微摄影，这使得对微生物的记录更加准确。在十九世纪的显微镜中，比较具有代表性的显微镜有:•莱德的学生显微镜•历史上最精美的显微镜----温汉姆的显微镜。•结构新颖的水生生物显微镜。莱德的学生显微镜•英国人WilliamLadd在1864年制造，采用了当时最先进的齿轮调焦装置•这个显微镜的镜臂上多出了一个在前几个世纪的显微镜上都看不到的东西----聚光镜•十九世纪的显微镜是今天光学显微镜的雏形•由英国伦敦人FrancisWenham在1882年制造。有着当时最为精巧先进的齿轮传动系统和齿轮调焦系统,聚光系统还有成像系统。•是十九世纪中性能最好的显微镜,也是历史上最精美的显微镜。温汉姆显微镜结构新颖的水生生物显微镜同时代的其它显微镜二十世纪的显微科学•由于人们在物理，数学和材料科学等领域取得非常大的进展，显微镜的质量大大提高。•各种新型的显微镜也应运而生。•各种新技术也相继出现。•数字成像技术开始了用计算机来处理传送显微影象的时代，使人们记录显微影象的方式又前进了一步二十世纪中比较具有代表性的显微镜•JamesSwift与Son的双目解剖显微镜•同时代的解剖镜还有:美国的鲍施和Lomb的解剖显微镜。现代解剖显微镜的结构都是以这个显微镜为模板。•最经典的复式显微镜:蔡司实验室显微镜•当时与这种显微镜结构相近的显微镜有:AndrewRoss的显微镜;沃森和Sons的显微镜。它们都是最早具有(物镜)转换器的显微镜。新型的现代光学显微镜•暗视野显微镜•相差显微镜•倒置显微镜•荧光显微镜•万能研究显微镜暗视野显微镜特点：暗视野显微镜不具备观察物体内部的细微结构的功能，但可以分辨0.004μm以上的微粒的存在和运动。因而常用于观察活细胞的结构和细胞内微粒的运动等。暗视野显微镜的基本原理是丁达尔效应。丁达尔效应：当一束光线透过黑暗的房间，从垂直于入射光的方向可以观察到空气里出现的一条光亮的灰尘“通路”，这种现象即丁达尔效应。暗视野显微镜在普通的光学显微镜上换装暗视野聚光镜后，由于该聚光器内部抛物面结构的遮挡，照射在待检物体表面的光线不能直接进入物镜和目镜，仅散射光能通过，因而视野是黑暗的。操作者通过目镜观察到的，是检物体的衍射光图像。相差显微镜环形光阑相位板相差显微镜的基本原理：通过环形光阑和相位板把透过标本的可见光的相位差（光程差）变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。倒置显微镜物镜方向朝上，标本放在物镜上方，从下面观察样品。适用于观察培养皿中的样品，广泛适应于细胞培养领域。使用相差技术的这种显微镜称作相差倒置显微镜荧光显微镜•荧光显微镜(Fluorescencemicroscope)：•荧光显微镜是以紫外线为光源，用以照射被检物物体，使之发出荧光，然后在显微镜下观察物体的形状及其所在位置。荧光显微镜用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位等。细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一。荧光显微镜按照光路原理可分为两种1.透射式荧光显微镜：较为旧式的荧光显微镜，其激发光源通过聚光镜穿过标本材料来激发荧光。其优点是低倍镜时荧光强，而缺点是随放大倍数增加其荧光减弱。所以它仅适用于观察较大的标本材料。2.落射式荧光显微镜：激发光从物镜向下落射到标本表面，即用同一物镜作为照明聚光器和收集荧光的物镜(附图1-5)。光路中需加上一个双色束分离器（分色镜），它与光轴呈45º角，激发光被反射到物镜中，并聚集在样品上，样品所产生的荧光以及由物镜透镜表面、盖玻片表面反射的激发光同时进入物镜，返回到双色束分离器，使激发光和荧光分开，残余激发光再被阻断滤片吸收。如换用不同的激发滤片／双色束分离器／阻断滤片的组合插块，可满足不同荧光反应产物的需要。此种荧光显微镜的优点是视野照明均匀，成像清晰，放大倍数愈大荧光愈强。透射式荧光显微镜目镜镜吸收滤色镜物镜暗场聚光镜激发滤色镜汞灯透射式荧光显微镜原理图落射荧光显微镜落射荧光显微镜原理万能研究显微镜•万能研究显微镜功能繁多：有明视野，暗视野，相差，偏振，微分干涉，荧光，显微摄影等等，有的还具有显微操作的功能。是一种高档次的显微镜。•光学显微镜的放大倍数已达到了理论的极限，因为不论镜片弧度多么精准无误，透镜组合多么完美，显微镜分辨率最多也只能达到光波长的一半——自然光的平均波长为0.55µm，所以分辨率能达到0.275µm，最好的光学显微镜能把物体放大2000倍，这是细菌的量级。要想继续看小下去，必需质的飞跃。电子显微镜•质的飞跃发生在1924年。32岁的德布罗意证明电子也和光子一样具有波动性，令人惊喜的是其波长本身就比光子短。上述研究使德布罗意马上博士毕业，5年后，为他赢得了诺贝尔物理学奖，自此开创博士论文获得诺奖的先河；而它对本篇文章最有意义的贡献是：它提供了理论依据，说明电子为何能像光子一样做显微镜的“光源”；利用德布罗意公式可以算出，电子的速度能被电场加到特别大，以至波长缩到光子的1/100000。如果用电子做“光源”，那么显微镜分辨率则可以本质性地提高，就可以看到更加细微的物体了。•1931年，一束轻盈的电子在一条一米多高的巨型金属柱中加速（图为一台1933年制作的电镜），继而被汇聚在一些小网格样品上，将小格放大了14.4倍。这台试验品就被定义为“世上第一台电子显微镜”（电镜），尽管放大本领和一把手持放大镜差不多，但它却标志人类首次以电代光“照”出了物体的影像。执行这项工程的德国科学家卢斯卡也因此在55年后被颁予诺贝尔奖。电镜诞生后，电子被不断提速，其波长越来越短，能照出的细节也越来越精致——10年之内，电镜的理论分辨率已达10纳米，是细胞膜的厚度。1、电子显微镜的基本结构•电子光学系统•真空系统•供电系统•机械系统•观察显示系统照明系统成像系统•今日，一般电镜分辨率已达1纳米，能将物体放大200万倍，细胞、细胞里的膜、膜上的分子世界豁然开朗；如果再让电子疯狂加速，加上软件的帮忙，不到1埃（=0.1纳米）的原子也能分辨清楚1945年的这张划时代照片标志人类从此获得进入细胞的门票，而将之记录下来的电镜元老来自美国RCA透射电子显微镜透射电子显微镜是以电子束透过样品经过聚焦与放大后所产生的物像，投射到荧光屏上或照相底片上进行观察。透射电镜的分辨率为0.1～0.2nm，放大倍数为几万～几十万倍。扫描电子显微镜镜扫描电子显微镜的工作原理是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子由探测体收集，并在那里被闪烁器转变为光信号，再经光电倍增管和放大器转变为电信号来控制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像扫描隧道显微镜扫描隧道显微镜是根据量子力学原理中的隧道效应和三维扫描而设计。当原子尺度的针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压（2mV~2V），针尖与样品之间产生隧道效应而有电子逸出，形成隧道电流，通过隧道电流获取显微图像，而不需要光源和透镜。“扫描隧道显微镜”因此而得名。光学显微镜下的世界苏铁根横切片10×4松幼雄球花纵切10×4电子显微镜下的世界电子显微镜下的三种病毒扫描电镜下的巨噬细胞未来显微镜的发展一、拍得更清晰二、放大倍数更高三、更为人性化的设计四、一体化的显微镜五、专门的网络化显微镜六、光源的革新一、拍得更清晰•显微镜厂商为此开发出各种各样的显微镜镜头来消除各种色差和场曲。•最近，在显微镜上普遍采用了UIS2光学系统，它充分体现了无限远校正方式的优越性。UIS2无限远光学系统的物镜具有在宽波长范围内（由紫外至近红外区）具有一致的高透过率。同时具有更高的信噪比，不需要额外补偿就可以得到更为清晰的图像二、放大倍数更高•通常情况下，目镜的放大倍数为10倍或者16倍。以40倍物镜为例，也不过是放大400倍或者是640倍，如今却能够将放大倍数提高到840倍。例如美国AMG公司开发的倒置显微镜，在物镜下采用了21倍的光学放大，使得我们能够通过40倍的物镜就可以观察到放大倍数更高的图像了。如果换成100倍的油镜，就可以通过显示器观察到放大到惊人的2100倍甚至更高的图像，无不让人赞叹技术的发展之快。三、更为人性化的设计四、一体化的显微镜•也许现在我们接触到的显微镜大多是机械式的，需要手动来调焦距、调光源、调样品的位置，特别是针对细胞培养，出现了大量连续培养过程中显微观察的要求。为此，各个显微镜厂商设计了能够用于连续培养显微观察的显微镜或配件五、专门的网络化显微镜•一些公司已经研制出为临床远程病理会诊提供方便的显微镜，它们专门为载玻片显微观察设计，自动转换物镜，自动对焦，得到的图像可直接通过网络发送到异地进行专家会诊。六、光源的革新•对于荧光显微镜，到现在为止绝大多数显微镜还在使用卤钨灯或者是高压汞灯，一方面这类光源使用寿命短，需要3到4各月更换一次，每次更换后都需要专业工程师进行位置校准；另外一方面，这类光源的强度会随着使用寿命而衰减；还有一方面，这类光源对于显微镜操作来说需要预热来等待光源强度稳定，而且光源关闭后需要等待30分钟左右才能重启.•总观显微科学几百多年的历史,显微科学也得到了飞速发展。我们可以看到,任何一个学科的发展都离不开其它学科的支持。谢谢！