生化-双缩脲法测定蛋白质含量

实验双缩脲法测定蛋白质浓度实验目的1.学习蛋白质含量测定的原理和方法2.掌握双缩脲法测定蛋白质含量的方法蛋白质含量测定的原理和方法微量凯氏定氮法被测的天然含氮化合物与浓硫酸共热时分解出氨，氨与硫酸反应生成硫酸铵。在凯氏定氮仪中加入强碱消化液，使硫酸铵分解出氨。用水蒸汽蒸馏法将氨蒸入无机酸溶液中，然后再用标准酸溶液进行滴定，滴定所用无机酸的量(mol)相当于被测样品中氨的量(mol)，根据所测得的氨量即可计算样品的含氮量。因为蛋白质含氮量通常在16%左右，所以将凯氏定氮法测得的含氮量乘上系数6.25，便得到该样品的蛋白质含量。消化CO2+SO2+H2O+NH3↑+浓H2SO4NNH3+H2SO4(NH4)2SO4蒸馏H2O+Na2SO4+NH3↑(NH4)2SO4+NaOH吸收NH3+H3BO3NH4HB4O7+H2O滴定NH4HB4O7+HCl+H2ONH4Cl+H3BO3氮的总量测定—凯氏定氮法原理：当脲加热至180oC时，两分子脲缩合，放出一分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性条件下能与硫酸铜生成紫红色络合物，即发生双缩脲反应。蛋白质分子中含有肽键，与双缩脲结构相似，故蛋白质与碱性硫酸铜也能形成紫红色络合物,在一定条件下其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，可用来进行蛋白质定量。最大波长位于540nm处。本法测定蛋白质范围为1-10mg双缩脲法540nmFolin-酚试剂法(Lowry法)Folin酚反应是在双缩脲反应的基础上，引进Folin试剂(磷钼酸—磷钨酸试剂)，蛋白质—铜络合物能还原磷钼酸—磷钨酸试剂，生成蓝色物质。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比例。本法的优点是操作简便、灵敏度高（20-250g）、较紫外吸收法灵敏10—20倍，较双缩脲法灵敏100倍。其不足之处是此反应受多种因素干扰。紫外分光光度法由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值(OD280)与其含量呈正比关系，可用作定量测定。利用紫外吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。总蛋白定量分析－BCA（Bicinchoninicacid，二辛可宁酸、二羧基二喹啉）准确灵敏：BCA试剂的蛋白质测定范围是20－2000μg/mL；MicroBCA试剂测定范围是0.5-20μg/mL快速：45分钟内完成测定，比经典的Lowry法快4倍而且更加方便经济实用：除试管外，测定可在微孔板中进行，大大节约样品和试剂用量不受样品中离子型和非离子型去污剂影响检测不同蛋白质分子的变异系数小于考马斯亮蓝基本原理：碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。考马斯亮蓝染色法考马斯亮蓝在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律，因此可以通过测定染料在595nm处光吸收的增加量得到与其结合的蛋白质量。该法简单、迅速、干扰物质少、灵敏度高10－100μg（比Lowry法灵敏4倍）。CoomassieDye-Based蛋白质定量PROTEIN+Amax=595nmBLUEAcidCoomassieG-250Protein-DyeComplexOCH2CH3NHCCH3CH3NCH2SO3-CH3CH2NCH2CH2CH3SO3Na+蛋白质含量的测定紫外吸收法双缩脲法Folin-酚法考马斯亮蓝法检测波长280nm540nm650nm595nm检测范围0.1-1.0mg1-10mg25-250µg10-100µg繁琐程度简便较简便较简便较简便应用纯度高样品快速但不十分精确受多种因素干扰干扰较少本次实验采用双缩脲法测定蛋白质含量原理：当脲加热至180oC时，两分子脲缩合，放出一分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性条件下能与硫酸铜生成紫红色络合物，即发生双缩脲反应。蛋白质分子中含有肽键，与双缩脲结构相似，故蛋白质与碱性硫酸铜也能形成紫红色络合物,在一定条件下其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，可用来进行蛋白质定量。最大波长位于540nm处。本法测定蛋白质范围为1-10mg双缩脲法540nm一、操作步骤1.取15支试管，按下表编号、加试剂（做2个平行组）管号0123456样品牛血清白蛋白(mg)00.61.22.43.64.86.02mg/mL牛血清白蛋白体积(mL)00.30.61.21.82.43.0－待测液体积(mL)－－－－－－－3.0*（取2个不同体积）蒸馏水(mL)3.02.72.41.81.20.600OD5402.各管混匀后，加入双缩脲试剂3.0mL，37oC反应30min。3.以0号管调零，测定各管540nm光吸收值。二、结果处理1.绘制标准曲线以牛血清白蛋白含量为横坐标，OD540为纵坐标，绘制标准曲线。2.样品的计算根据样品的OD540从标准曲线上查得样品的蛋白质含量（mg），再根据样品的体积计算出样品的浓度。三、注意事项1.须于显色后30min内测定，且各管由显色到比色时间应尽可能一致。2.样品蛋白质含量应在标准曲线范围内。3.用坐标纸绘制标准曲线，注明轴名称及单位。4.比色杯的使用