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专题二微生物的培养与应用课题一微生物的实验室培养1．说出培养基的类型、用途和基本成分；2．比较消毒与灭菌的区别及适用范围；3．举例说明常用的消毒与灭菌的方法；4．阐明培养基配制的方法；5．阐明接种的方法。一、培养基1．概念：人们按照微生物对___________的不同需求，配制出供其生长繁殖的__________。2．种类：配制成的液体状态的基质称为_________培养基，配制成的固体状态的基质称为_________培养基。营养物质营养基质液体固体3．成分：不同微生物培养往往需要不同的培养基配方，但是其基本成分一般都包括______、______、___和_________。在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对____、特殊营养物质以及______的要求。例如，培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加________，培养霉菌时需要将培养基的pH调至______，培养细菌时需要将培养基的pH调至______________，培养厌氧微生物时则需要提供______的条件。碳源氮源水无机盐pH氧气维生素酸性中性或微碱性无氧1．为什么各种培养基的具体配方不同，但一般都有水、无机盐、碳源和氮源？提示：微生物的化学组成与其他生物大体相同，也是主要由C、H、O、N、P、S等大量元素和Fe、Mn、Cu、Zn、B、Mo、Cl等微量元素组成，这些元素最终来自外界环境中的各种有机物和无机物，可归纳为碳源、氮源、水和无机盐。二、无菌技术1．获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，要注意以下几个方面(1)对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行_______________。(2)将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行_________。(3)为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在______________附近进行。(4)实验操作时应避免_______________的材料用具与周围的物品相接触。清洁和消毒灭菌酒精灯火焰已经灭菌处理2．消毒与灭菌的区别消毒灭菌概念使用较为_____的物理或化学方法杀死物体______或_______的部分微生物(不包括______________)使用_____的理化因素杀死物体内外______的微生物，包括_____和_______常用方法_______消毒法、______消毒法、___________消毒法、紫外线消毒法灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌适用对象操作空间、液体、双手等接种环、接种针、玻璃器皿、培养基等温和表面内部芽孢和孢子强烈所有芽孢孢子煮沸巴氏化学药剂三、大肠杆菌的纯化培养1．培养基的配制步骤：计算、称量、溶化、_______、倒平板。2．接种方法：微生物接种最常用的是_____________法和_______________法。(1)平板划线法：通过__________在琼脂______培养基表面连续_________的操作，将聚集的菌种逐步________分散到培养基的表面。灭菌平板划线稀释涂布平板接种环固体划线稀释(2)稀释涂布平板法：将菌液进行一系列的____________，然后将不同稀释度的菌液____________到琼脂固体培养基表面，进行培养。两种接种方法都是为了将聚集在一起的微生物______，得到由____________繁殖而来的肉眼可见的单个______。梯度稀释分别涂布分离单个细胞菌落2．配制试管培养基时搁置形成斜面的目的是什么？提示：试管培养基搁置成斜面的作用是增大接种面积和与氧气的接触面积。一、培养基的类型、培养基中各营养要素及配制原则1．培养基种类和功能划分标准培养基种类特点用途物理性质液体培养基不加凝固剂工业生产半固体培养基加凝固剂，如琼脂观察微生物的运动、分类鉴定固体培养基微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种划分标准培养基种类特点用途化学成分天然培养基含化学成分不明确的天然物质工业生产合成培养基培养基成分明确(用化学成分已知的化学物质配成)分类、鉴定用途选择培养基培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长培养、分离出特定微生物鉴别培养基根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品鉴别不同种类的微生物2.培养基中各营养要素及作用(1)微生物的元素组成：C、H、O、N、P、S等，其中C、H、O、N占细胞干重的90%以上。(2)营养要素的来源营养要素含义作用主要来源碳源凡能提供所需碳元素的物质构成生物体细胞的物质和一些代谢产物，有些是异养生物的能源物质无机化合物：CO2、NaHCO3等；有机化合物：糖类、脂肪酸、花生饼粉、石油等营养要素含义作用主要来源氮源凡能提供所需氮元素的物质合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物无机化合物：N2、NH3、铵盐、硝酸盐等；有机化合物：尿素、牛肉膏、蛋白胨等生长因子生长必不可少的微量有机物酶和核酸的组成成分维生素、氨基酸、碱基等营养要素含义作用主要来源水在生物体内含量很高，在低等生物体内含量更高不仅是优良的溶剂，而且可维持生物大分子结构的稳定无机盐为微生物提供除碳、氮元素以外的各种重要元素，包括某些大量元素细胞内的组成成分，生理调节物质；某些化能自养菌的能源，酶的激活剂①对异养微生物来说，含C、N的化合物既是碳源，也是氮源，即有些化合物作为营养要素成分时并不是单一方面的作用。②之所以要补充生长因子，往往是由于微生物缺乏合成这些物质所需的酶或合成能力有限。此外，在提供营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对pH以及氧气等的需求。如培养霉菌时需将培养基的pH调至酸性，培养细菌时需将pH调至中性或微碱性，培养厌氧微生物时则需要提供无氧的条件。3．配制原则(1)目的要明确(根据微生物的种类、培养目的等)。例如，培养基可由简单的无机物组成，生产用培养基内可加入化学成分不明确的天然物质，而分类鉴定用培养基内必须加入已知化学成分的物质。(2)营养要协调。注意各种营养物质的浓度和比例。(3)pH要适宜。各种微生物适宜生长的pH范围不同，如细菌、放线菌和真菌的最适pH分别为：6.5～7.5、7.5～8.5和5.0～6.0。1．关于微生物的营养，说法正确的是()A．同一种物质不可能既作碳源又作氮源B．凡是碳源都能提供能量C．除水以外的无机物仅提供无机盐D．有时无机氮源也可能提供能量解析：此题考查我们对微生物的营养和能源的理解。对一些微生物来说，含C、H、O、N的化合物既是碳源，又是氮源。CO2是光能自养细菌的碳源，但不能提供能量。CO2和N2是无机物，也是微生物的碳源和氮源。硝化细菌所利用的氮源是无机氮源氨，同时氨也为硝化细菌提供用以化能合成作用的能源。答案：D二、几种消毒和灭菌方法及其适用范围类型适用范围操作方法消毒方法煮沸消毒法日常生活100℃煮沸5～6min巴氏消毒法不耐高温的液体70～75℃煮30min或80℃煮15min化学药剂生物活体、水源等擦拭等，如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源紫外线房间、仪器设备紫外线照射30min类型适用范围操作方法灭菌方法灼烧接种工具、接种时用的试管口或瓶口等直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧干热灭菌耐高温、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿和金属用具等物品放入干热灭菌箱，160～170℃加热1～2h高压蒸汽灭菌培养基、培养皿等，生产和实验室常用高压蒸汽灭菌锅内，100kPa，温度121℃，15～30min用巴氏消毒法对牛奶进行消毒，可以杀死牛奶中的微生物，而牛奶的营养成分不会被破坏；紫外线照射30min可以杀死物体表面或空气中的微生物。在照射前，适量喷洒石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以加强消毒效果；对于那些培养基中需要、但加热会分解的化合物，如尿素、NaHCO3，不能使用高压蒸汽灭菌法，只能将其配成溶液，使用特定的器材单独过滤灭菌。2．细菌培养过程中分别采用了高压蒸汽、酒精、火焰灼烧等几种不同的处理，这些方法依次用于杀灭哪些部位的杂菌()A．接种针、手、培养基B．高压锅、手、接种针C．培养基、手、接种针D．接种针、手、高压锅解析：此题考查学生对无菌技术的掌握。高压蒸汽灭菌锅是灭菌的一个设备，通常用于培养基的灭菌。用酒精擦拭双手是消毒的一种方法。火焰灼烧，可以迅速彻底地灭菌，适用于微生物的接种工具，如接种环。答案：C三、微生物培养中有关实验操作及注意事项1．倒平板操作(1)培养基灭菌后，需冷却至50℃左右才能倒平板，原因是琼脂在44℃以下凝固。(2)培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，不要完全打开。(3)整个操作过程要在酒精灯火焰旁进行，避免杂菌污染。(4)平板冷凝后要倒置的原因：防止皿盖上的冷凝水落入培养基，造成污染。(5)若倒平板时，培养基溅在皿盖和皿底之间的部位，这个平板应丢弃。2．平板划线操作(1)第一次划线及每次划线之前都需灼烧接种环灭菌，划线操作结束后仍需灼烧接种环，每次灼烧目的如下表：第一次灼烧每次划线之前灼烧划线结束后灼烧目的避免接种环上可能存在的微生物污染培养基杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种，使每次划线的菌种来自上次划线的末端杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者(2)灼烧接种环之后，要等其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。(3)划线时最后一区域不要与第一区域相连。(4)划线用力要大小适当，防止用力过大将培养基划破。3．稀释涂布平板操作(1)稀释操作时：每支试管及其中9mL水、移液管均需灭菌；操作时，试管口和移液管应在离火焰1～2cm处。(2)涂布平板操作时：稀释涂布平板的操作比较复杂，且各个细节均需保证“无菌”，应特别注意：①酒精灯与培养皿的距离要合适。②吸管头不要接触任何其他物体。③吸管要在酒精灯火焰周围使用。4．对分离纯化效果的判断方法(1)培养时，要将接种后的培养基和一个未接种的培养基一同培养，未接种的培养基的作用是对照，若其表面有菌落形成，说明培养基灭菌不彻底，需要重新进行实验。(2)如果对照培养基上无菌落形成，可观察接种后的培养基。如果培养基上大肠杆菌菌落呈白色，为圆形，光滑有光泽，边缘整齐，则说明接种成功；如果出现了其他颜色、形状的菌落，说明有杂菌，需要重新进行分离纯化。培养时间不同，菌落大小会不同，因为时间越长，菌落中细菌繁殖越多，菌落体积越大；菌落数可能会增多，但已有的菌落分布位置应相同。3．有关稀释涂布平板法，叙述错误的是()A．首先将菌液进行一系列的梯度稀释B．然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面C．其核心是防止杂菌污染，保证培养液的纯度D．结果都可在培养基表面形成单个的菌落解析：通过一系列稀释操作，在稀释度足够高的菌液里，原本聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个菌落，但并不是每个培养基上都能形成单个菌落。答案：D培养基的类型及应用据表回答下列问题：编号①②③④⑤⑥⑦成分粉状硫(NH4)2SO4K2HPO4MgSO4FeSO4CaCl2H2O含量10g0.4g4.0g9.25g0.5g0.5g1000mL(1)上表培养基中可培养的微生物类型是______。(2)若除去②，加入(CH2O)，该培养基可用于培养______。(3)表中营养共有______类。(4)不论何种培养基，在各种成分溶化后分装前都要进行的是______。(5)上表中各成分重量确定的原则是_______________。(6)若表中培养基用于菌种鉴定，应增加的成分是_________________________。解析：本题考查培养基的营养配方。(1)在确定培养基的成分及用量时要依据所培养微生物的生长需要，该培养基含有氮源、水、无机盐，没有碳源，说明所培养的微生物只能从空气中获取碳源，即为自养微生物。(2)从培养基中除去(NH4)2SO4(氮源)，加入(CH2O)(有机碳源)，该培养基可用于培养固氮微生物。(3)培养基各种成分都溶化后一般先调整pH，灭菌后分装；也可于灭菌前分装。答案：(1)自养微生物(2)固氮微生物(3)3(4)调整pH(5)依据微生物的生长需要确定(6)琼脂(或凝固剂)病毒为非细胞结构的生物，专营活细胞寄生，不能利用人工