溶氧对发酵的影响及其控制

溶氧对发酵的影响及其控制摘要：发酵液中的溶氧浓度（DissolvedOxygen，简称DO）是影响发酵的关键因素，对微生物的生长和产物形成有重要的影响。要根据氧的溶解特性及微生物对氧的需求，分析溶氧对发酵的影响及对发酵产物的影响，进而确定溶氧量的控制及在发酵液中的传递，使生产效益最大化。关键词：溶氧发酵代谢溶氧量控制传递Abstract:Thedissolvedoxygenconcentrationinthefermentationbroth(DissolvedOxygen,referredtoasDO)isthekeyfactortoinfluencethefermentation,hasanimportantinfluenceonmicrobialgrowthandproductformation.Accordingtothedemandofdissolutioncharacteristicsandmicrobialoxygenonoxygen,analysisoftheeffectsofdissolvedoxygenonthefermentationandtheeffectonfermentation,andthendeterminethecontrolofdissolvedoxygeninthefermentationbrothandtransfer,themaximumproductionefficiency.Keywords:dissolvedoxygen;fermentation;metabolism;Dissolvedoxygencontroltransfer溶氧浓度（DO）作为发酵控制中的一个关键参数，直接影响着发酵生产的稳定性和生产成本，受到工业生产和实验室研究的重视，无论是厌氧还是需氧发酵，研究发酵液中溶氧对发酵的影响都有重要意义。一·氧的溶解特性溶解氧（DissolvedOxygen）是指溶解于水中分子状态的氧，用DO表示。氧是一种难溶气体，在常压、25℃的条件下，空气中的氧在纯水中的溶解度仅约为0.25mmol/L，在发酵液中，由于各种溶解的营养成分、无机盐和微生物[3]的代谢产物存在，会明显降低氧的溶解度。此外，溶氧浓度会随着温度、气压、盐分的变化而变化。一般说来，温度越高，溶解的盐分越大，水中的溶解氧越低；气压越高，水中的溶解氧越高。其中就提到一个临界溶氧浓度的确定。临界溶氧浓度的确定，如右图：[2]在发酵过程中停止供气，通过观察发酵体系中DOT的变化可以大致确定细胞生长的临界溶氧浓度。从图1可以看出，当DOT低于30％后，耗氧速率开始降低，细胞代谢速率减慢，呼吸强度降低。因此可以认定为30％是细胞生长的临界DOT.二、微生物对氧的需求好氧微生物生长和代谢均需要氧气，因此供氧必须满足微生物在不同阶段的需要，在不同的环境条件下，各种不同的微生物的吸氧量或呼吸强度是不同的。微生物的吸氧量常用呼吸强度和摄氧率两种方法来表示，呼吸强度是指单位质量的干菌体在单位时间内所吸取的氧量，以QO2，表示，单位为mmolO2／(g干菌体•h)。当氧成为限制性条件时，比耗氧速率为：QO2=(QO2)mCL/（K0+CL）(QO2)m--------最大比耗氧速度,mol/(kg.s)K0--------氧的米氏常数,mol/m3CL----------溶解氧的浓度，mol/m3摄氧率是指单位体积培养液在单位时间内的耗氧量，以r表示，单位为mmolO2／(L•h)。呼吸强度可以表示微生物的相对吸氧量，但是，当培养液中有固体成分存在时，对测定有困难，这时可用摄氧率来表示。微生物在发酵过程中的摄氧率取决于微生物的呼吸强度和单位体积菌体浓度。微生物的比耗氧速率的大小受多种因素影响，当培养基中不存在其他限制性基质时，比耗氧速率随溶氧浓度增加而增加，直至某一点，比耗氧速率不再随溶氧浓度的增加而增加，此时的溶氧浓度称为呼吸临界氧浓度(criticaloxygenconcentrationOfrespiration)，以Ccr表示。呼吸临界溶氧浓度一般指不影响菌体呼吸所允许的最低氧浓度，如对产物形成而言便称为产物合成的呼吸临界氧浓度。当不存在其他限制性基质时，溶解氧浓度高于临界值，细胞的比耗氧速率保持恒定；在临界氧浓度以下，微生物的呼吸速率随溶解氧浓度降低而显著下降，细胞处于半厌气状态，代谢活动受到阻碍。培养液中维持微生物呼吸和代谢所需的氧保持供氧与耗氧的平衡，才能满足微生物对氧的利用。由此可知，只有使溶氧浓度大于其临界氧浓度时，才能维持菌体的最大的比耗氧速率，以使菌体得到最大的合成量。但由于发酵的目的是为了得到发酵的产物，因此，由氧饥饿而引起的细胞代谢干扰，可能对形成某些产物是有利的。所以，需氧发酵并不是溶氧愈大愈好。即使是一些专性好氧菌，过高的溶氧对生长可能不利。氧的有害作用是通过形成新生O，超氧化物基O2-和过氧化物基O22-或羟基自由基OH-，破坏许多细胞组分体现的。有些带巯基的酶对高浓度的氧敏感，好气微生物曾发展一些机制，如形成触酶，过氧化物酶和超氧化物歧化酶，使其免遭氧的摧毁。溶氧高虽然有利于菌体生长和产物合成，溶氧太大有时反而抑制产物的形成。为避免发酵处于限氧条件下，需要考查每一种发酵产物的临界氧浓度和最适氧浓度，并使发酵过程保持在最适浓度。最适浓度的大小与菌体和产物合成代谢的特性有关，这是由实验来确定的。发酵生产中，供氧的多少应根据不同的菌种、发酵条件和发酵阶段等具体情况决定。例如谷氨酸发酵在菌体生长期，希望糖的消耗最大限度地用于合成菌体，而在谷氨酸生成期，则希望糖的消耗最大限度地用于合成谷氨酸。因此，在菌体生长期，供氧必须满足菌体呼吸的需氧量，即r=Qo2c(X)，若菌体的需氧量得不到满足，则菌体呼吸受到抑制，而抑制生长，引起乳酸等副产物的积累，菌体收率降低。但是供氧并非越大越好，当供氧满足菌体需要，菌体的生长速率达最大值，如果再提高供氧，不但不能促进生长，造成浪费，而且由于高氧水平抑制生长。同时高氧水平下生长的菌体不能有效地产生谷氨酸。三、影响微生物需氧量的因素在需氧微生物发酵过程中影响微生物需氧量的因素很多，除了和菌体本身的遗转特性有关外，还和下列一些因素有关：1．培养基培养基的成分和浓度对产生菌的需氧量的影响是显著的。培养基中碳源的种类和浓度对微生物的需氧量的影响尤其显著。一般来说，碳源在一定范围内，需氧量随碳源浓度的增加而增加。在补料分批发酵过程中，菌种的需氧量随补入的碳源浓度而变化，一般补料后，摄氧率均呈现不同程度的增大。2、菌龄及细胞浓度不同的生产菌种，其需氧量各异。同一菌种的不同生长阶段，其需氧量也不同。—般说，菌体处于对数生长阶段的呼吸强度较高，生长阶段的摄氧率大于产物合成期的摄氧率。在分批发酵过程中，摄氧率在对数期后期达到最大值。因此认为培养液的摄氧率达最高时，表明培养液中菌体浓度达到了最大值。3、培养液中溶解氧浓度的影响在发酵过程中，培养液中的溶解氧浓度(CL)高于菌体生长的临界氧浓度(C长临)时，菌体的呼吸就不受影响，菌体的各种代谢活动不受干扰；如果培养液中的CL低于C长临时，菌体的多种生化代谢就要受到影响，严重时会产生不可逆的抑制菌体生长和产物合成的现象。4、培养条件若干实验表明，微生物呼吸强度的临界值除受到培养基组成的影响外，还与培养液的pH、温度等培养条件相关。一般说，温度愈高，营养成分愈丰富，其呼吸强度的临界值也相应增高。5、有毒产物的形成及积累在发酵过程中，有时会产生一些对菌体生长有毒性的如CO2等代谢产物，如不能及时从培养液中排除，势必影响菌体的呼吸，进而影响菌体的代谢活动。6、挥发性中间产物的损失在糖代谢过程中，有时会产生一些挥发性的有机酸，它们随着大量通气而损失，从而影响菌体的呼吸代谢。2溶氧对发酵影响溶解氧对发酵的影响分为2个方面：一是溶氧浓度影响与呼吸链有关的能量代谢，从而影响微生物生长；二是氧直接参与产物合成。溶氧对微生物自身生长的影响根据对氧的需求，微生物可分为专性好氧微生物、兼性好氧微生物和专性厌氧微生物。专性好氧微生物把氧作为最终电子受体，通过有氧呼吸获取能量（如霉菌）；进行此类微生物发酵时一般应尽可能地提高溶解氧（DO）以促进微生物生长，增大菌体量。兼性好氧微生物的生长不一定需要氧，但如果在培养中供给氧，则菌体生长更好（如酵母菌）；乙醇发酵时，对DO的控制分2个阶段：初始提供高DO值进行菌体扩大培养，后期严格控制DO值进行厌氧发酵。厌氧和微好氧微生物能耐受坏境中的氧，但它们的生长并不需要氧，这些微生物在发酵生产中应用较少。而对于专性厌氧微生物，氧则可对其显示毒性（如产甲烷杆菌），此时能否限制DO值在一个较低水平往往成为发酵成败的关键。溶解氧对微生物自身生长的影响体现在多个方面，其中对微生物酶的影响是不可忽略的重要因素。XIAOJ等。研究了不同溶氧对谷氨酸发酵中2个关键酶（谷氨酸脱氢酶（GDH）和乳酸脱酶（LDH）对代谢流的影响，研究表明，在过低溶氧条件下，TCA循环代谢流量减小，不足以平衡葡萄糖酵解速率，从而刺激了LDH的酶活，使代谢流转向乳酸生成，造成乳酸积累；而过高溶氧时，GDH酶活明显降低，且TCA循环流量加大，生成大量CO2，造成碳源损失，2种情况均不利于谷氨酸生成。啤酒工业中，在啤酒的发酵阶段，酵母菌的繁殖需要有足够的氧气，在除此之外的任何阶段都应极力避免氧的参与。啤酒发酵液总含氧量由酒体溶解氧和瓶颈空气2部分组成，一般情况下啤酒中的含氧量超过2mg/L时对生产就有明显的危害。因为氧气的存在会促使酵母菌采取有氧呼吸的代谢途径，从而破坏乙醇发酵的厌氧代谢过程。但是研究表明，无氧条件下发酵生成的乙醇低于溶氧控制在1%~4%条件下生成的乙醇。这主要是由于无氧条件下的菌体量远远低于有氧条件下菌体量，而乙醇的生成与菌体量有很大的联系。类似微生物发酵的活性污泥法处理污水的过程中，DO的影响及控制也十分重要。曝气池中氧气不足和过量都会对微生物生存环境带来不利影响。当氧气不足时，一方面由于曝气池中丝状菌会大量繁殖，最终产生污泥膨胀；另一方面会降低细菌分解的效果，延长处理时间，甚至导致生物处理失效。而氧气过量（即过量曝气）则会由于絮凝剂遭到破坏而导致悬浮固体沉降性变差，同时使能耗过高。四：溶氧对发酵产物的影响对于好氧发酵来说，溶解氧通常既是营养因素，又是环境因素。特别是对于具有一定氧化还原性质的代谢产物的生产来说，DO值的改变势必会影响到菌株培养体系的氧化还原电位，同时也会对细胞生长和产物的形成产生影响。在黄原胶发酵中[4]，虽然发酵液中的溶氧浓度对菌体生长速率影响不大，但是对菌体浓度达到最大之后的菌体的稳定期长短及产品质量却有着明显的影响。需氧微生物酶的活性对氧有着很强的依赖性。谷氨酸发酵中，高溶氧条件下乳酸脱氢酶（LDH）活性明显比低溶氧条件下的LDH酶活要低，产酸中后期谷氨酸脱氢酶（GDH）酶活下降很快，可能是由于在高溶氧条件下，剧烈的通气和搅拌加剧了菌体的死亡速度和发酵活性的衰减。DO值的高低还会改变微生物代谢途径，以致改变发酵环境甚至使目标产物发生偏离。研究表明，L-异亮氨酸的代谢流量与溶氧浓度有密切关系，可以通过控制不同时期的溶氧来改变发酵过程中的代谢流分布，从而改变异亮氨酸等氨基酸合成的代谢流量。五：溶氧量的控制对溶解氧进行控制的目的是把溶解氧浓度值稳定在一定的期望值或范围内。在微生物发酵过程中，溶解氧浓度与其他过程参数的关系极为复杂，受到生物反应器中多种物理、化学和微生物因素的影响和制约。氧的传递速率也可看出，对DO值的控制主要集中在氧的溶解和传递2个方面。（1）控制溶氧量（C*-CL）是氧溶解的推动力，控制溶氧量首要因素是控制氧分压（C*）。高密度培养往往采用通入纯氧的方式提高氧分压，而厌氧发酵则采用各种方式将氧分压控制在较低水平。如啤酒发酵中麦汁充氧和酵母接种阶段，一般要求氧含量达到8mg/L~10mg/L；而啤酒发酵阶段，一般啤酒中的含氧量不得超过2mg/L[5]。此外，由于氧是难溶气体，在一定温度和压力下，DO值有一上限。为此，向发