DNA的限制性酶切及电泳分析

DNA的限制性酶切及电泳分析实验目的：1．掌握限制性核酸内切酶消化DNA的原理。2．掌握重组质粒DNA的酶切鉴定方法。3．掌握琼脂糖凝胶电泳分析酶切结果。基本原理限制性核酸内切酶是一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶（水解磷酸二酯键）。根据酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。通常所指的DNA限制性核酸内切酶就是Ⅱ型酶。主要试剂:重组质粒DNA插入片段300bp本实验所用限制性核酸内切酶为EcoRⅠ，其识别顺序为：5′----G↓AATTC----3′3′----CTTAA↑G----5′磷酸二脂键断裂产生5′粘性末端。操作步骤1.反应体系的建立：⑴在一无菌1.5mlEppendorf无菌双蒸水7μl10×酶切缓冲液2μl质粒DNA(100ng/μl)10μlEcoRⅠ(5U/μl)1μl总体积为20μl⑵轻轻混匀，12000rpm离心5sec。2.37℃水浴1h。3.将Eppendorf管置65℃水浴中10min，通过加热使酶失活以终止反应。4.12000rpm离心5sec，将管盖及管壁上的水离下。5.取10μl消化产物，与2μl6×上样缓冲液混匀，琼脂糖凝胶电泳检测消化效果，电泳条件：约100V30～60min。6结果观察。操作注意事项：1.吸样量一定要准确2.为了不使酶污染而导致浪费，最后才加酶3.要求在冰上操作，并充分混匀，4.开启Eppendorf管时，手不要接触到管盖内面，以防污染。5.样品在37℃与65℃保温时，将离心管盖严，以防水进入管内造成实验失败。限制性内切酶酶解中常见的问题和原因1．DNA完全没有被限制性内切酶切割：①限制性内切酶失活；②DNA不纯，含有SDS、有机溶剂、EDTA等；③非限制性内切酶最佳反应条件；④酶切位点被修饰；⑤DNA上不存在该酶的识别顺序。2．DNA切割不完全：①限制性内切酶活性下降或稀释不正确；②DNA不纯或反应条件不佳；③酶切位点被修饰；④部分DNA溶液粘在管壁上；⑤酶切后DNA粘末端退火。3．DNA片段数目多于理论值：①限制性内切酶星号活力；②存在第二种限制性内切酶污染；③样品DNA中含有其它DNA。