搜索
TakaraCode：DRR036APrimeScript®RTMasterMixPerfectRealTime（200次量）宝生物工程(大连)有限公司说明书目录内容页码●制品说明1●制品内容1●保存1●特长1●RNA样品制备1●使用注意3●操作方法3●实验例：反转录反应时间和cDNA合成量的研讨实验6●引物设计说明7●引物设计服务说明7●制品说明本制品是2StepRealTimeRT-PCR用的最佳反转录反应试剂。5×PrimeScript®RTMasterMix中含有定量RT-PCR的反转录反应所需的所有试剂（PrimeScriptRTase、RNaseInhibitor、Random6mers、OligodTPrimer、dNTPMixture、反应Buffer），加入模板RNA和水即可迅速进行反应。使用具有较强延伸能力的PrimeScript®RTase，与以前制品PrimeScript®RTreagentKit（PerfectRealTime）（TakaraCode：DRR037）相同，可以在较短时间内高效合成RealTimePCR用模板cDNA。本制品合成的cDNA可以用于SYBRGreen分析法和TaqMan探针分析法，可以根据实验目的与TakaraCode：DRR420/DRR820/DRR091/DRR071/DR075/DRR390等试剂配合使用，能够进行高性能的基因表达分析。●制品内容（10μl反应×200次）1.5×PrimeScript®RTMasterMix（forRealTime）*1400μl2.RNaseFreedH2O1ml×2支3.EASYDilution（forRealTimePCR）*21ml*1含有PrimeScriptRTase、RNaseInhibitor、Random6mers、OligodTPrimer、dNTPMixture、反应Buffer。*2制作标准曲线时梯度稀释cDNA或RNA标准品的稀释液。模板cDNA或RNA如果用水或TEBuffer稀释时，由于受Microtube吸附作用等的影响，往往不能准确地进行稀释，导致实验结果精度降低。使用本制品时，即使稀释至低浓度也能够进行准确地稀释，容易在宽广范围内获得准确定量的标准曲线。EASYDilution也可以单独购买（TakaraCode：D9160）。EASYDilution请与本公司RealTimePCR试剂组合使用，对于其他公司的同类制品的适用性本公司尚未进行确认。●保存：-20℃。●特长1．制品为预先混好的Premix形式，只需加入模板RNA和水便可以开始反应。2．可以在较短时间内高效合成RealTimePCR用cDNA，是进行2StepRealTimeRT-PCR反应的最佳试剂。3．使用了Random6mers和OligodTPrimer2种反转录引物，可以合成最适的RealTimePCR用cDNA。4．制品中附加了标准曲线制作用稀释液EASYDilution（forRealTimePCR），将TotalRNA或cDNA稀释至低浓度时也能够进行准确稀释，容易在宽广范围内获得准确定量的标准曲线。●RNA样品制备本制品是将RNA反转录成cDNA的专用试剂。RNA的纯度会影响cDNA的合成量，而制备RNA的关键是要抑制细胞中的RNA分解酶和防止所用器具及试剂中的RNA分解酶的污染。因此，在实验中必须采取以下措施：戴一次性干净手套；使用RNA操作专用实验台；在操作过程中避免讲话等等。通过以上办法可以防止实验者的汗液、唾液中的RNA分解酶的污染。-1-【使用器具】尽量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，应在使用前按下列（1）或者（2）方法进行处理。（1）干热灭菌（180℃，60min）（2）用0.1%DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在37℃下处理12小时。然后在120℃下高压灭菌30分钟以除去残留的DEPC。RNA实验用的器具和仪器建议专门使用，不要用于其它实验。【试剂配制】用于RNA实验的试剂，需使用干热灭菌（180℃，60min）或用上述方法进行DEPC水处理灭菌后的玻璃容器盛装（也可使用RNA实验用的一次性塑料容器），使用的无菌水需用0.1%的DEPC处理后进行高温高压灭菌。RNA实验用的试剂和无菌水都应专用，避免混用后交叉污染。【制备方法】使用简单的RNA纯化方法即可获得满足于RT-PCR反应的RNA（只需少量的RNA便可进行RT-PCR反应）。但为了保证实验的成功率，建议使用GTC法（异硫氰酸胍法）制备的高纯度RNA。从培养细胞、组织中提取时，使用RNAisoPlus（TakaraCode:D9108）。【TotalRNA中混有基因组DNA的对策】提取的TotalRNA中常常混有基因组DNA，而基因组DNA可以直接作为PCR模板进行扩增，造成解析结果不准确。为了避免这种情况发生，我们必须采取如下两种措施：1、引物设计时避免基因组DNA扩增；2、使用DNaseI处理除去基因组DNA。1.引物设计时避免基因组DNA扩增我们可以利用基因组DNA具有外显子和内含子的结构，在引物设计上下工夫，使PCR反应时不能扩增基因组DNA。此时我们首先应确认目的基因的基因组结构，选择较长的内含子。然后，在这个内含子两侧的外显子上分别设计上、下游引物。RealTimePCR反应时通常扩增的目的DNA片段长度都比较短，设置的条件也是适合短片段DNA的扩增，超过500bp就很难扩增了。所以，当内含子足够长时，基因组DNA来源的扩增就不能发生；当内含子较短时，基因组DNA来源的扩增可能发生，但基因组DNA来源的扩增产物比mRNA来源的扩增产物长，可通过分析融解曲线的方法加以区分。但是，此种方法不适合具有单个外显子的基因、或者不具有内含子的生物种以及基因组情报没被解析的生物种等，此时必须采取2、的方法解决。2.使用DNaseI处理除去基因组DNA使用常规方法提取TotalRNA后，再使用DNaseI分解混入的基因组DNA，最后进行苯酚/氯仿抽提、乙醇沉淀等纯化TotalRNA。◆操作流程①按下列组份配制反应液。试剂使用量TotalRNA20-50μg10×DNaseIBuffer5μlRNaseInhibitor20UDNaseI（RNase-free）2μl（10U）RNaseFreedH2Oupto50μl②37℃20min。③使用以下两种方法使DNaseI失活。-2-A．热处理（1）加入2.5μl0.5MEDTA80℃2min。（2）用RNaseFreedH2O定容至100μl。B．苯酚/氯仿抽提（1）用50μlRNaseFreedH2O定容至100μl后加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）混匀。（2）室温，13,500rpm5min离心，取上清。（3）加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1）混匀。（4）室温，13,500rpm5min离心，取上清。④加入10μl3M醋酸钠，250μl冷乙醇，冰上放置10min。⑤4℃，13,500rpm15min离心，弃上清。⑥加入500μl70%冷乙醇洗净，4℃，13,500rpm5min离心，弃上清。⑦沉淀干燥。⑧加入适量RNaseFreedH2O溶解。【基因组DNA确认方法】不进行反转录反应，通过RealTimePCR确认基因组DNA混入量。此实验使用从基因组DNA和mRNA中都能进行扩增的Primer。DNaseI处理后的基因组DNA处理情况也可以通过此方法进行确认。另外，使用跨内含子对基因组DNA不能进行扩增的Primer也有扩增产物时，怀疑有伪基因存在，这种情况也可以用此方法进行确认。●使用注意以下为使用本试剂盒时的注意事项，使用前一定认真阅读。1．5×PrimeScript®RTMasterMix在使用前要小心地离心收集到反应管底部。由于5×PrimeScript®RTMix粘度高，用移液枪慢慢反复吸打充分混匀后使用。2．分装试剂时务必使用新的枪头（Tip），以防止样品间污染。3．本制品中已经加入了反转录Primer（OligodTPrimer和Random6mers），想使用GeneSpecificPrimer进行反转录反应时不能使用本制品。●操作方法1.反转录反应。①按下列组份配制RT反应液（反应液配制请在冰上进行）。试剂使用量终浓度5×PrimeScript®RTMasterMix（forRealTime）2μl1×TotalRNA*RNaseFreedH2Oupto10μl*反应体系可按需求相应放大，10μl反应体系可最大使用500ng的TotalRNA。②反转录反应条件如下:37℃15min（反转录反应）85℃5sec（反转录酶的失活反应）4℃-3-③将得到的RT反应液加入到下一步的RealTimePCR反应体系中，其加入量不要超过RealTimePCR反应体积的1/10（V/V）量。2.RealTimePCR反应。以下是使用本制品进行反转录反应后，选择SYBR®PremixExTaqTMII（PerfectRealTime）（TakaraCode：DRR081）进行RealTimePCR反应的操作方法。采用TaqMan®探针法进行检测时，请选择PremixExTaqTM（ProbeqPCR）（TakaraCode：DRR390）。◆应用ThermalCyclerDice®RealTimeSystem扩增仪的操作方法请按照ThermalCyclerDice®RealTimeSystem（TakaraCode：TP800）的使用说明书要求进行实验操作。①按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。试剂使用量终浓度SYBR®PremixExTaqTMII（2×）12.5μl1×PCRForwardPrimer（10μM）1.0μl0.4μM*1PCRReversePrimer（10μM）1.0μl0.4μM*1RT反应液（cDNA溶液）2μl*2dH2O（灭菌蒸馏水）8.5μlTotal25μl*1通常引物终浓度为0.4μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.2～1.0μM范围内调整引物浓度。*2建议在25μl反应液中使用相当于10pg～100ngTotalRNA量的cDNA为模板。反转录反应液的加入量不能超过PCR反应液总体积的10%。②进行RealTimePCR反应。建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序。退火/延伸时间可在20～30秒范围内进行调整，推荐使用30秒的条件。由于使用Tm值较低的引物等原因，两步法PCR反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法PCR扩增反应。两步法PCR扩增标准程序：Stage1：预变性Repeat：195℃30秒Stage2：PCR反应Repeat：4095℃5秒60℃30秒Stage3：Dissociation**使用SYBR®GreenI时进行。◆特别提示：本制品中使用的TaKaRaExTaqHS是利用抗Taq抗体的HotStart用DNA聚合酶，与其他公司的化学修饰型HotStart用DNA聚合酶相比，不需要PCR反应前的95℃、5～15分钟的酶的活性化反应。如果高温处理时间过长，会使酶的活性下降，其PCR的扩增效率、定量精度等都会受到影响。如果在PCR反应前进行模板的预变性，通常设定为95℃、30秒。-4-③实验结果分析。反应结束后确认RealTimePCR的扩增曲线和融解曲线（使用SYBR®GreenI时），进行PCR定量时制作标准曲线等。◆应用ABIPRISM®7000/7700/7900HT，7300/7500/7500FastReal-TimePCRSystem的操作方法请按照LifeTechnologies公司的仪器使用说明书要求进行实验操作。①按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。试剂使用量使用量终浓度SYBR®PremixExTaqTMII（2×）10μl25μl1×PCRForwardPrimer（10μM）0.8μl2μl0.4μM*1PCRReversePrime