郜刚分子生物学-03-染色体-2包装和半保留复制-59页PPT文档

2.3DNA的复制DNA—ReplicationandSynthesis第二章染色体与DNA•TransmissionelectronmicrographofhumanaHeLacell,illustratingthereplicationbubblethatcharacterizesDNAreplicationwithinasinglereplicon.APicturePaintsaThousandWords...ormore?Becauseafigureisasinformativeas1000words….DNAReplicationMode1.ThreePossibleModesofDNAReplication（1）Conservativereplication（全保留复制）（2）Dispersivereplication（分散复制）2.3.1DNA的半保留复制核酸复制规律的一般猜想在DNA复制时，DNA并不需要解链，只是在复制位点解开几个碱基，亲代分子保持完整。在这个模型中，亲代分子并不需要解链。亲代DNA分子先打成片段然后再互为模板，这样的话，亲代DNA片段分散在子代DNA分子中（3）Semiconservativereplication（半保留复制）unwoundrewoundBasematchGeneralizedmodelofsemiconservativereplicationofDNAMatthewMesselsonFranklinStahl中国科学院上海生化与细胞所2019年招收硕士研究生分子遗传学入学考试：请设计一个实验来证明DNA复制是以半保留方式进行的（8分）。Meselson－Stahl实验：1958年，Meselson和Stahl首先将大肠杆菌在含重同位素15N的培养基中培养约十五代，使所有细菌都被15N标记。然后移至只含有轻同位素14N的培养基中同步培养一代，二代，三代。分别提取DNA，作CsCl密度梯度离心，观察DNA的位置。15N标记的DNA密度大于正常14N的DNA密度，在离心管较低的部位形成一条区带；正常的DNA应该在它的上面。这种重标记的DNA在14N培养液中复制一代，重密度带消失了，而在比正常DNA稍低的地方形成一个带，即中间密度带（如果是半保留复制，在第一代中，DNA是密度杂交分子，两条链中一条链是亲代15N标记的重链，另一条是正常含14N的轻链，这样两条链形成密度上杂交的DNA分子）。在14N培养液中再复制一代，就会出现两条带，一条在中间密度区域，一条在轻密度区域。随着在14N培养液中培养的代数的增加，中间密度区的区带量逐渐减少，低密度区带的量逐渐增加，但并不出现新的区带。这个实验证明了DNA的复制是半保留复制。TheMeselson-Stahlexperiment.themostbeautifulexperimentinbiology15N标记氮源14N标记细胞在14N中复制一次细胞在14N中再复制一次细胞在14N中再复制一次TheexpectedresultsoftwogenerationsofsemiconservativereplicationintheMeselson-Stahlexperiment..Meselson－Stahl实验的改进之一•对15N-DNA、14N-DNA杂交分子经加热变性，对于变性前后的DNA分别进行CsCl密度梯度离心。•结果变性前的杂交分子为一条中间密度带，变性后则分为两条区带，即重密度带（15N-DNA）和低密度带（14N-DNA）。第0代只有15N，第一代出现杂合分子，两代后出现等量的14N和14N-15N杂合分子。纯粹15N的分子没有的了，说明老链保留到了新链中了。3.SemiconservativeReplicationinEukaryotesTaylor-Woods-Hughesexperiments：1957,roottipsofViciafaba（蚕豆）Radioisotope3HlabeledthymidineAutoradiography（放射自显影）蚕豆病是葡糖六磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏者进食蚕豆后发生的急性溶血性贫血。蚕豆(viciafaba)又名胡豆黄TelophaseResultsSemi-conservativereplicationofchromosomescanalsobevisualizedthroughanexaminationofchromosomesthatareallowedtworoundsofreplicationinamediumcontainingbromodeoxy-uridine.ThesereplicatedchromosomesarethenstainedwithafluorescentdyeandGiemsastaintoproducewhataredescribedasharlequinchromosomesDNA半保留复制的生物学意义DNA的半保留复制表明DNA在代谢上的稳定性，保证亲代的遗传信息稳定地传递给后代。为了保证遗传的稳定性，在每次细胞分裂之前，遗传信息载体必须精确地复制自己。过去的概念认为遗传信息的载体就是DNA，现在发现许多病毒的遗传信息载体是RNA而不是DNA。因此，我们除了对DNA的复制作详细的论述外，对RNA的复制也加以阐述，以期对遗传信息的复制有个全面的了解。1953年，Watson和Crick在提出DNA双螺旋模型时就指出，由于互补碱基的配对原则，在DNA复制时，只要双链DNA解开，以每一条链为模板以合成其互补链，即可形成两个与亲代完全一样的DNA分子。DNA复制的基本过程正如Watson和Crick所预测的那样，但是在DNA复制中涉及了许多细胞成分。DNA的复制过程大体上可以分为复制的启动，复制的延伸，和复制的终止三个阶段。•DNA复制在生物细胞中要从DNA分子上特定位置开始。这个特定的位置就称为复制起点(Originofreplication)，用ori表示oriori2.3.2复制的起点方向和速度一个复制子：replicon一个复制子：replicon大肠杆菌Singleorigin,BidirectionalReplicationoriCter复制叉复制叉复制速度E.coli37℃0.5h105bp/min•MultipleOriginsinEukaryotes复制速度mammaliancell500-5000bp/min复制的多模式单起点、单方向（原核）多起点、单方向（真核）单起点、双方向（原核）多起点、双方向（真核）腺病毒、Φ29噬菌体、线粒体等2.3.3复制的几种主要方式page40•“复制方式”不同于“复制机制”•线性DNA的复制：典型的复制叉式的复制•环状DNA的复制：θ复制滚环复制D环复制2.3.3DNA复制的几种主要方式1.线性DNA双链的复制特点在于：1、多个起点，起点都不在线性DNA的端点（末端），而是在内部2、采用复制叉式的双向复制，两个复制叉，两个方向，有先导链和后随链之分3、末端的复制采用特殊的3种方式（后面讲）4、真核生物采用的复制方式：2.环状DNA双链的复制•θ复制:首先由J.Carins从大肠杆菌中观察到,又称为Carins复制。（双向复制）•滚环复制（rollingcirclereplication)（单向复制）•D环复制（Dloopreplication)：线粒体DNA复制（单向复制）JohnCairns’experimentIn1963,JohnCairns:GrewE.coliin3HthymidineWaitedtillcellswereinthemiddleofreplicationLysedthecellsveryverygentlySpreadthelysateonanEMgridExposedthegridtoX-rayfilmforTWOmonthsReplicationoftheE.colichromosome经典实验分析OriginofReplicationθ复制约翰·凯恩斯Thereplicationeyebecomeslargerasthereplicationforksproceedalongthereplicon.Notethattheeyebecomeslargerthanthenonreplicatedsegment.Thetwosidesoftheeyecanbedefinedbecausetheyareboththesamelength.PhotographkindlyprovidedbyBernardHirt.OriginscanbemappedbyautoradiographyandelectrophoresiswhatCairns’experimentshowed:θE.colihasacircularchromosomeE.colihasasingleoriginofreplicationInE.coli,replicationandunwindingaresimultaneousJohnCairnsprovidedawell-designeddemonstrationofE.colichromosomalreplicationin1963.Inhisexperiment,heradioactivelylabeledthechromosomebygrowinghisculturesinamediumcontaining3H-thymidine.Thenucleosidebasewasincorporateduniformlyintothebacterialchromosome.Hethenisolatedthechromosomesbylysingthecellsgentlyandplacedthemonanelectronmicrograph(EM)gridwhichheexposedtoX-rayfilmfortwomonths.ThisExperimentclearlydemonstratesthethetareplicationmodelofcircularbacterialchromosomesWhatCairnsdidnotshow:•Isreplicationunidirectionalorbidirectional?•Istheoriginofreplicationunique?•Whereistheoriginofreplicationlocated?①Cyclechromosome②Semicoservativereplication③DirectlymeasurethechromosomallengthofE.coliConclusions:④Unwound-replicate-rewound⑤Onlyoneorigin（oriC）Twocycleslinkedasapattern.1100m11000003.4=3.2106bpθ复制的特点•多数环状DNA采用的复制方式•复制叉式复制，两个复制叉，双向等速或者不等速复制•有先导链和后随链之分滚环复制环状亲本DNA，双链ori限制性内切酶在复制起点识别特异序列，切开一条单链3’-OH5’-p5’末端常常与特殊的蛋白质结合，受到保护，而在3’末端不断地由DNA聚合酶催化，以没有切断的那条环形链为模板，合成新的互补链3’-OH5’-p3’-OH这里的新生链是共价结合在模板链的互补链上的3’端不断的滚动，而5’端则不断地被甩出去？以单链为模板，通过不连续复制（冈崎片段），复制出另外一条链，最后通过切割和连接重新环化。φX174滚环型复制：单向复制的特殊方式T.Brownetal.,如：ΦΧ174的双链环状DNA复制型（RF）（1）模板链和新合成的链分开;（2）不需RNA引物，新生链在正链3‘－OH上共价延伸延伸（3）只有一个复制叉;复制是单向的(4)滚环复制也有先导链和后随