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DNA复制DNA复制可能的三种方式由Meselson和Stahl设计证明半保留复制的实验的被誉为生物学最美丽的实验半保留复制实验亲代DNA；15N标记在15N标记培养基中培养：15N标记DNA移到14N标记DNA培养基中氯化铯密度梯度超离心•15NDNA在14NDNA培养基中培养第1~….n代亲代F1F2FnMeselson和Stahl的证明DNA半保留复制的实验流程Meselson和Stahl的实验结果Meselson与Stalh在42年以后在最初他们相遇的一颗树下重逢时的合影半保留复制的实验结果•15NDNA显示为一条重密度带位于离心管的管底。•15NDNA和14N-DNA的杂交分子中密度带。•第二代有中密度带及低密度带两个区带，这表明它们分别为15N14N－DNA和14N-DNA。•在14N培养基中培养代数的增加，低密度带增强，而中密度带逐渐减弱。半保留复制进一步的实验证椐•15NDNA、14NDNA杂交分子经加热变性，对于变性前后的DNA分别进行CsCl密度梯度离心。•结果变性前的杂交分子为一条中密度带，变性后则分为两条区带，即重密度带(15NDNA)及低密度带(14NDNA)。15NDNA第一代变性前后超离心15NDNA第一代：变性前变性后排除了弥散复制Taylor以蚕豆根尖细胞为材料、使用放射性同位素证明真核细胞DNA也是半保留复制的实验。DNA的半保留复制两条链分别做模板各自合成一条新的DNA链，子代DNA分子中一条链来自亲代DNA，另一条链是新合成的，这种复制方式称为半保留复制。某些生物DNA复制的引物序列证明DNA复制的方向始终是5′→3′的末端终止实验DNA复制起始区的特征①由多个短的重复序列组成；②能够被多亚基的复制起始区结合蛋白识别；③通常富含AT碱基对，这有利于DNA复制起动时的解链，因为AT碱基对含有的氢键数目低于GC碱基对。DNA复制起始区的特征电镜下真核生物DNA的多个复制叉结构复制叉的结构当DNA复制从起始区起动的时候，起始区的DNA双链因发生解链而形成叉状结构，这样的结构被称为复制叉真核生物DNA复制子Cairns的实验复制开始时，将大肠杆菌放在含低剂量的[3H]-dT的培养基中培养几分钟；随后，将细菌转移到含高剂量的[3H]-dT的培养基中继续培养一段时间；最后，收集细胞，小心地裂解以抽取其中的染色体DNA进行放射自显影。如果是单向复制，自显影图谱上银颗粒的密度应该是一端高、一端低；如果是双向复制，则应该中间是一段低密度的银颗粒，两侧是高密度的银颗粒。低密度银颗粒意味着这一段DNA属于复制起始区，高密度颗粒代表的是后来合成的。Cairns证明大肠杆菌DNA双向复制的实验ReijiOkazaki的实验脉冲标记——目的在于即时标记在特定时段内合成的DNA。和脉冲追踪——目的则是要弄清那些被标记上的DNA片段后来的去向。Okazaki的脉冲标记和脉冲追踪的实验脉冲标记•在培养时，培养基中加入同位素[3H]标记的dTTP，经30秒后，DNA刚开始复制，分离DNA，然后在碱中沉淀，变性，让新合成的单链和模板链分开，再用CsCl密度梯度离心，以沉降的快慢来确定片段的大小，再检测放射标记，结果表明被3H标记的片段，也就是新合成的片段，沉淀系数为20S左右，即都是长1000~2000Nt的DNA片段，而亲本链要比它大20~50倍；脉冲追踪•这个实验是先进行标记培养30秒，以后除去同位素继续培养几分钟，再分离DNA在碱中沉淀，检测结果。先合成的（带标记）的DNA不再是短片段，而和总DNA的情况相似，沉淀系数为70S~120S较长的片段，这意味着刚开始合成的片段都是短片段，以后再连接成长片段，人们就把最初合成的短片段称为冈崎片段（Okazakifragment）Okazaki的脉冲标记和脉冲追踪的实验结果分析不连续复制由于这个实验的结果使得人们普遍认为：无论是前导链还是后滞链都是先合成小片段，然后在连成大片段，称为“不连续复制“（discontinuousreplication）在复制叉中不连续合成的DNA片段称为冈崎片段，连续合成的DNA子链被称为前导链，不连续合成的DNA子链被称为后随链或滞后链。1978年Olivera提出了半不连续（semidiscontinuous）复制模型，也就是说前导链上的合成是连续的，只有后滞链上的合成才是半连续的。•由于细胞内都存在有dTTP和dUTP，而DNApolⅢ却并不能区分它们，因此也会将dUTP加入到DNA中，形成A·U对。那么在DNA中为什么没有U的存在呢？这是因为E.coli细胞里有双重“保险”，防止了U的“混入”。•第一道关是细胞里的dUTPase，它能使dUTP变成dUMP，dUMP是不能作为DNA合成的底物，这样它就不再能加入DNA中。但总还有些漏网之“鱼”，它们还是逃过此关，混入DNA中，这就靠第二道关来清除“异己”，这道关的主角是尿嘧啶N-糖苷酶（uracilN-glycosylase），它可以切断混合尿苷的糖苷键，形成无Pu和Py位点（apurinicorapyrimidinic，AP），再由AP内切酶在AP位点切出一个缺口，进一步进行切除修复。在细胞内尿嘧啶N-糖苷酶作用较快，而AP酶作用较慢，在新链合成之初约1200bp就有可能掺进一个U，但很快就被尿嘧啶N-糖苷酶切断糖苷键，在AP酶未作用前在脉冲标记实验中就提取了，用NaOH沉淀时，AP位点十分易断裂，所以前导链也成了小片段。ＤＮＡ复制的速度和方向DNA复制过程的三个阶段•DNA复制的起始阶段，包括起始点，复制方向以及引发体的形成。•DNA链的延长，包括前导链及随从链的形成和切除RNA引物后填补空缺及连接岗崎片段。•DNA复制的终止阶段。（一）DNA复制的起始阶段•复制是从DNA分子上的特定部位开始的，复制起始点(originofreplication)常用ori或o表示，称为复制子或复制单元(replicon)。•在原核细胞中只有一个复制起始点，一个复制子。•在真核生物中复制是从许多起始点同时开始的，即有多个复制子。1、DNA复制起始点的结构特性•大肠杆菌Ori由422个核苷酸组成，是一系列对称排列的反向重复序列，即回文结构(palindrome)。•有些生物复制起始点Ori是富含A·T的区段。这些特殊的结构对于在DNA复制起始过程中参与的酶和许多蛋白质分子的识别和结合都是必须的。2、DNA复制的方向性•定点开始双向复制：•定点开始单向复制：•两点开始单向复制：ori3、DNA复制的起始•DNA双螺旋的解旋由多种酶来完成的•DNA解链酶：水解ATP获能解开双链DNA•单链结合蛋白（SSB蛋白）：保持单链结构•RNA聚合酶：合成RNA引物•对于随从链是由引发体来完成的，引发体由6种蛋白组成：n、n/、n//、DnaB、C、I（二）DNA链的延长•DNA的复制实际上就是以DNA为模板在DNA聚合酶作用下，将四种dNTP聚合成DNA的过程。•需要许多种酶和蛋白质参与。1、DNA聚合酶•1957年，Arthurkornberg首次在大肠杆菌中发现DNA聚合酶Ⅰ简写DNApolⅠ，后来又相继发现了DNA聚合酶Ⅱ和DNA聚合酶Ⅲ。•大肠杆菌中DNA复制的主要过程靠DNApolⅢ起作用，而DNApolⅠ和DNApolⅡ在DNA错配的校正和修复中起作用。真核生物DNA聚合酶•真核生物DNA聚合酶有α、β、γ、δ及ε。复制中起主要作用的是DNApolα。•β与DNA修复有关。•γ在线粒体DNA的复制中起作用。•δ前导链合成靠δ催化，还需要调节因子参与。•随从链的合成靠α和引发酶配合作用完成。DNA聚合酶的性质•需要DNA模板•需要RNA做为引物•催化dNTP加到引物的3′-OH末端•DNA聚合酶都属于多功能酶，它们在DNA复制和修复过程的不同阶段发挥作用。2、与超螺旋松驰有关的酶•拓扑异构酶(topoisomerase)改变DNA拓扑性质的酶，松驰超螺旋，有利于复制叉的前进合成。•拓扑异构酶有Ⅰ型和Ⅱ型，原核、真核中均有。（三）DNA复制的终止阶段•大肠杆菌DNA具有复制终止位点，此处可以结合一种特异的蛋白质分子叫做Tus，通过阻止解链酶(Helicase)的解链活性而终止复制。“滚环复制”某些噬菌体（如M13和ФX174）DNA和一些小的质粒（如枯草杆菌内的pIM13质粒）在宿主细胞内通过滚环复制方式扩增DNA。真核细胞的某些基因，如某些两栖动物卵母细胞内的rRNA基因和哺乳动物细胞内的二氢叶酸还原酶基因，在特定的情况下会通过滚环复制在较短的时间内迅速增加目标基因的拷贝数。滚环复制D-环复制线粒体和叶绿体DNA通常以D-环的方式进行复制。少数病毒，如腺病毒，也进行D-环复制。催化线粒体DNA复制的酶是DNA聚合酶γ，两条链的合成都需要先合成RNA引物，但都不形成冈崎片段，因此都是连续合成。两条子链的合成在时间上的不同步。D环复制干细胞分裂过程中的“不朽链假说”干细胞的分裂是不对称的，而分裂的不对称性使以后的干细胞能够选择性得到含有最老的DNA模板的染色体。这样的假设是合乎逻辑的，因为如果一个干细胞在分裂中抓住最老的DNA，就等于将复制可能产生的错误“拒之门外”，从而大大降低了细胞癌变的可能性，而将来分化成体细胞的子细胞得到易错的新DNA也没有什么危险，因为它们很快停止分裂或者死亡，特别是在高度更新的组织。NoImage“不朽链假说”图解原核生物DNA复制的特点过程复杂；需要多种酶和蛋白质参与（包括拓扑异构酶、解旋酶、单链DNA结合蛋白、引物合成酶、DNA聚合酶及连接酶等）。原核生物DNA复制的特点1.DNA复制的起始•复制起始原点•DNA双螺旋的解旋•复制的引发大肠杆菌(E.coli)的OriC复制原点大肠杆菌基因组的复制原点位于天冬酰胺合酶和ATP合酶操纵子之间，全长245bp,称为oriC。参与DNA复制起始和引发的蛋白质•DNA解旋酶(DNAhelicase)催化DNA双链的解链过程。•单链DNA结合蛋白(singlestrandDNAbindingprotein)：以四聚体形式存在于复制叉处，只保持单链的存在，并不能起解链作用。•DNA拓扑异构酶(DNAtopoisomerase)消除DNA双链的超螺旋堆积。•引物酶(primase)合成一小段RNA引物，为DNA新链的合成提供3’-OH末端。1.1解旋酶（helicase)DNA复制时，解旋酶利用ATP的能量启动DNA解旋，使双连分开形成单链。1.DNA双螺旋的解旋在Ecoli中，解旋酶DnaB作为引发体的成员，参与复制叉形成，并结合于一个复制叉，利用ATP水解的能量解开双螺旋，推动复制叉向前延伸;大部分DNA解链酶可沿后随链的5’-3‘方向随着复制叉的前进而移动，Rep蛋白则沿前导链模板的3’-5‘方向移动。生物体内的解旋酶有多种，有些解旋酶还参与DNA修复，重组等非复制过程。1.2拓扑异构酶（topoisomerase)可以使DNA的两种拓扑异构体互变的酶。DNA分子在细胞内以超螺旋形式存在，DNA拓扑异构酶催化同一DNA分子不同超螺旋状态之间转变。ActionoftopoisomeraseatthereplicationforkTopoisomeraserapidlyremovethepositivesupercoilsaccumulateinfrontofthereplicationfork.功能：与DNA形成共价结合中间体，使DNA磷酸二酯键断裂，形成DNAnick，DNA的一条链进行解旋旋转而改变DNA分子的拓扑状态。v参与复制、转录、重组。效应：拓扑异构酶可使DNA发生：连环化（catenate)脱连环化(decatenate)打结（knot)解结（unknot)拓扑异构酶类别•拓扑异构酶IDNA拓扑异构酶I对单链DNA的亲和力要比双链高得多，这正是它识别负超螺旋DNA的分子基础，因为负超螺旋DNA常常会有一定程度的单链区。负超螺旋越高，DNA拓扑异构酶I作用越快•生物体内负超螺旋稳定在5%左右，低