第十一章-质谱技术在蛋白质多肽化学

第十一章质谱技术在蛋白质、多肽化学中的应用第一节蛋白质、多肽质谱技术的发展第二节蛋白质、多肽质谱技术介绍第三节质谱在蛋白质、多肽分析中的应用第一节蛋白质、多肽质谱技术的发展一、基本原理质谱分析法(massspectrometry)是将化合物形成离子和碎片离子，按其质荷比(Ｍ/Ｚ值)的不同进行分离测定，来进行成分和结构分析的一种分析方法。蛋白质、多肽质谱是通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子，然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值(Ｍ/Ｚ值)的蛋白质离子分离开来，经过离子检测器收集分离的离子，确定离子的Ｍ/Ｚ值，分析鉴定未知蛋白质。蛋白质、多肽质谱发展史20世纪60年代科学家们曾注意到质谱技术在蛋白质和肽的结构分析中存在的潜力，但由于离子化技术的限制，近30年来，质谱技术只在有机化合物小分子的结构测定中得到应用，而对于大分子(分子量超过1000Da)、极性分子和难气化的分子，则显得无能为力。70年代Macfarlane等人发明了一种叫等离子体解吸(Plasmadesorption,PD)的离子化技术，使得质谱测定分子量范围扩大到几千道尔顿。80年代初Barber等人又引入了快原子轰击(fastatombombardment，简称FAB)电离技术，并成功地测定了一个26肽的结构，从而使得质谱技术应用于蛋白质和肽的结构测定这一设想变为现实。80年代末两种更新的技术得到发展，它们分别是JohnFenn发明的电喷雾电离(electrosprayionization，ESI)和Hillenkamp等人发明的基质辅助的激光解吸电离(matrixassistedlaserdesorptionionization,MALDI)。这两种技术解决了极性大、热不稳定的蛋白质、多肽分子的离子化和大分子量的测定问题。另外，这两种质谱无论在灵敏度、准确性和在分析混合物的复杂性方面都比以前的技术有了显著的改善，从而大大拓宽了质谱技术在蛋白质领域中的应用，可以说是质谱技术在生物大分子中应用的一场革命。第二节蛋白质、多肽质谱技术介绍蛋白质、多肽质谱质谱技术介绍一．质谱仪组成二．离子源三．质量分析器四．检测器五．串联质谱及联用技术质谱仪组成质谱仪一般由四部分组成：进样系统——按电离方式的需要，将样品送入离子源的适当部位；离子源——用来使样品分子电离生成离子，并使生成的离子会聚成有一定能量和几何形状的离子束；质量分析器——利用电磁场（包括磁场、磁场和电场的组合、高频电场、和高频脉冲电场等）的作用将来自离子源的离子束中不同质荷比的离子按空间位置，时间先后或运动轨道稳定与否等形式进行分离；检测器——用来接受、检测和记录被分离后的离子信号。质谱仪组成计算机数据处理系统真空系统加速区进样系统离子源质量分析器检测器SampleinletIonisationsourceIonseparationDetectorOutput离子源离子源的功能是将进样系统引入的气态样品分子转化成离子。由于离子化所需要的能量随分子不同差异很大，因此，对于不同的分子应选择不同的离解方法。通常称能给样品较大能量的电离方法为硬电离方法，而给样品较小能量的电离方法为软电离方法，后一种方法适用于易破裂或易电离的样品。离子源离子源是质谱仪的心脏，可以将离子源看作是比较高级的反应器，其中样品发生一系列的特征降解反应，分解作用在很短时间(～1μs)内发生，所以可以快速获得质谱。离子化的方法电子轰击电离ElectronImpactIonization，EI化学离子化ChemicalIonization，CI场电离，场解吸FieldIonizationFD，FieldDesorptionFD快原子轰击FastAtomBombardment，FAB电喷雾电离ElectrosprayIonization，ESI基质辅助激光解析电离Matrix-AssistedLaserDesorptionIonization，MALDI大气压化学电离AtmosphericPressureChemicalIonization，APCI离子化的方法根据不同的离子化方法，常用的适用于蛋白质、多肽研究的质谱技术方法包括FAB-MS、ESI-MS、MALDI-TOF-MS等，而其中又以MALDI-MS和ESI-MS应用最为广泛，这两个新技术明显增加了质谱范围和敏感度，从而导致了新的软件和检测器的发展。FAB-MS直到80年代FAB质谱问世，质谱技术才真正推广到蛋白质领域。它是一种用快速原子轰击被分散在高沸点溶剂(如甘油)中的待测化合物，从而产生分子离子。快原子的产生是通过电离隋性气体Ar、Xe或He产生的Ar+、Xe+或He+被电场加速，从而具有较大动能，以后通过Ar气室进行电荷交换反应：Ar+（高动能的）+Ar（热运动的）→Ar（高动能的）+Ar+（热运动的）经电荷交换后的低动能(热)的Ar+被偏转出快原子流，获得高动能快速的Ar原子对样品分子进行轰击，一般样品调在甘油基质之中，当快原子束轰击在涂有样品的金属板上，快原子大量动能以各种方式消散，其中的一些能量导致样品的挥发和离解。FAB-MSFAB-MS特点这种方法要求简单，灵敏较高。FAB产生的分子离子非常稳定，不易裂解，是准确测定多肽化合物分子量的有效方法。应用于一些较复杂的混合物，能测出其各组份的分子量。当然由于不易获得碎片峰，FAB质谱在测定多肽顺序时遇到困难。ESI-MS电喷雾离子化技术（electrosprayionization，ESI）利用强静电场从溶液直接产生气态离子化分子。ESI可以与液相色谱、高效液相色谱、毛细管IEF以及毛细管电泳等多种进样器联用。流出液在高电场下形成带电喷雾，在电场力作用下穿过气帘。ESI-MSESI-MSESI一般分为正离子ESI和负离子ESI两类。正离子ESI的原理：在一个金属喷嘴的针尖上加有2.5～6kV高电压，经强电场作用，样品溶液从针尖小孔喷出，成为一个个带正电的液滴。在迎面吹来的热氯气流的作用下，液滴表面溶剂蒸发，液滴变小，液滴的电荷密度骤增。当静电排斥力等于液滴的表面张力时，液滴便发生崩解，形成更小的液滴。如此形成的小液滴以类似的方式继续崩解，于是，液滴中的溶剂迅速蒸干，产生多电荷正离子，在质谱仪内被分析纪录。负离子EIS的过程与此类似，唯电性相反。ESI-MSRayleighLimitReached++++++++++-----++++++++++-----++++++--++++++--Evaporation++ChargedDroplets试样离子准分子离子AnalyteIonsSolventIonClustersSalts/IonpairsNeutrals++++++++--其他离子ESI-MS这种分子离子特点是分子离子往往带多个电荷。这些离子的形成是靠吸附上或失去若干个质子而形成，所以在正离子或负离子谱上会观察到(M+nH)n+或(M-nH)n-的峰。对于生物大分子，在ESI谱上出来的往往是一组带不同电荷的分子离子峰，根据仪器上记录下来的每个峰的质荷比及电荷数即可算出分子量值。实际上从一组峰上可算出无数个分子量值，它们相互之间会略有差别，一般需在计算机上经特定的程序处理，找出最接近实际的分子量值。ESI-MS特点优点：解决了极性大、热不稳定的蛋白质与多肽分子的离子化和大分子质量、一级结构和共价修饰位点的测定问题，并可用于研究DNA与药物、金属离子、蛋白质和抗原与抗体的相互作用。缺点：样品中的盐类对样品结果影响很大，而且单个分子带电荷不同可形成多种离子分子峰（重叠峰），所以对混合物的图谱解析比较困难。MALDI-MS基质辅助的激光解析电离(matrix-assistedlaserdesorptionionization,MALDI)技术产生的离子常用飞行时间(time-off-flight,TOF)检测器来检测，所以MALDI名字常与TOF联在一起，即叫基质辅助的激光解析飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS)。简而言之，基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱测量仪是将多肽成分转换成离子信号，并依据质量/电荷之比(m/z)来对该多肽进行分析，以判断该多肽源自哪一个蛋白。MALDI-MS待检样品与含有在特定波长下吸光的发光团的化学基质(matrix)混合，此样品混合物随即滴于一平板或载玻片上进行挥发，样品混合物残余水份和溶剂的挥发使样品整合于格状晶体中，样品然后置于激光离子发生器(lasersource)。激光作用于样品混合物，使化学基质吸收光子而被激活。此激活产生的能量作用于多肽，使之由固态样品混合物变成气态。MALDI-TOF-MS由于多肽分子倾向于吸收单一光子，故多肽离子带单一电荷.这些形成的多肽离子直接进入飞行时间质量分析仪(TOFmassanalyzer)。飞行时间质量分析仪用于测量多肽离子由分析仪的一端飞抵另一端探测器所需要的时间。而此飞行时间同多肽离子的质量/电荷的比值成反比，即质量/电荷之比越高，飞行时间越短TOF质量分析器被认为是与MALDI的最佳搭配。MALDI-TOF-MSMALDI-MS特点对于一些分子量较大(＞1000000Da)或疏水性强的蛋白质，MALDI比ESI更有效。MALDI能有效地分析较复杂的肽混合物或物理化学性质相差较大的蛋白质混合物。只要能与所选择的底物形成稳定的分散体系的样品都能用MALDI进行分析。MALDI不受样品所含的添加物、缓冲液或盐的影响，且灵敏度也比别的离子化方式高。软电离ESI和MALDI这两种“软电离”技术解决了极性大、热不稳定的蛋白质的离子化和大分子生物的分子质量的测定问题。而且，这两种方法在灵敏度、准确度和分析混合物的复杂性方面都比以前的质谱技术有了显著的改善，Yes±0.005%-0.01%to50kDA±0.02%-0.03%to150kDA≤150kDALowtolerance(≤20mM)fornonvolatilebuffers,alkalimetalsalts,detergents;onlineLC-MSusedforcontaminantremovalESINo±0.01%-0.05%to25kDA±0.05%-0.3%to300kDA≥350kDAHightolerance(≥50mM)foralkalimetalsalts,phosphate,urea,etc.;tolerantofsomenonionicdetergents;intolerantofSDSMALDICompatiblewithon-lineLC/CE-MSMassassignmentaccuracyMWrangeToleranceforbuffers,salts,anddetergentsIonizationmethod生物质谱两种主要电离方法比较质量分析器质量分析器将带电离子根据其质荷比加以分离，用于纪录各种离子的质量数和丰度。质量分析器的两个主要技术参数是所能测定的质荷比的范围（质量范围）和分辨率。扇形磁分析器四极杆分析器离子阱分析器飞行时间分析器傅里叶变换分析器扇形磁分析器不同质荷比的离子在磁场的作用下，前进方向产生不同的偏转，从而使离子束发散。由于不同质荷比的离子在扇形磁场中有其特有的运动曲率半径，通过改变磁场强度，检测依次通过狭缝出口的离子，从而实现离子的空间分离，形成质谱。四极杆分析器离子束在与棒状电极平行的轴上聚焦，一个直流固定电压（DC）和一个射频电压（RF）作用在棒状电极上，两对电极之间的电位相反。对于给定的直流和射频电压，特定质荷比的离子在轴向稳定运动，其他质荷比的离子则与电极碰撞湮灭。离子阱分析器由两个端盖电极和位于它们之间的类似四极杆的环电极构成。端盖电极施加直流电压或接地，环电极施加射频电压（RF），通过施加适当电压就可以形成一个势能阱（离子阱）。根据RF电压的大小，离子阱就可捕获某一质量范围的离子。离子阱可以储存离子，待离子累积到一定数量后，升高环电极上的RF电压