心肌缺血再灌注实验设计思路课件

对心肌缺血再灌注心律失常起保护作用药物的药理设计试验演示目录背景知识试验原理试验方法试验材料试验步骤数据统计试验结果预测讨论背景知识缺血性心脏病和急性心肌梗死已成为当今威胁人类健康的两大主要杀手，而心肌缺血损伤和心肌缺血再灌注损伤是导致这两大病的主要病因。缺血性心脏病是由于血液供应中断一定时间后（一般30min)就会出现心肌细胞酸中毒，细胞器超微结构改变和功能障碍，导致不可逆性损伤甚至死亡，也称为缺血损伤。背景知识急性心肌梗死是由于血液供应中断一定时间后（一般30min)，为恢复心肌功能及时提供血液，由于在闭塞的冠动脉再通，缺血区血运重建后的一段时间内，可发生血压聚降，导致新功能不全，出现心律失常、猝死等病情恶化现象，也称为缺血再灌注损伤。试验原理氧自由基(ORG)是心肌细胞呼吸产能过成中的副产物，包括超氧过离子，羟自由基和过氧化氢等。OFR可引起脂质的过氧化，降低细胞膜流动性，增加它的通透性，损伤离子泵，引起细胞能量和离子稳态异常，最终导致肌细胞损伤甚至死亡。试验原理正常情况下，有机体存在的超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px)等内源性抗氧化防御系统可将OFR及时清除掉，维持正常的功能。在缺氧情况下，OFR明显下降而生成的潜能增强，当在恢复供氧时，OFR剧增超过了抗防御系统的清除能力，导致肌细胞损伤甚至死亡。试验方法采用在大鼠开胸结扎冠状动脉前降肢30min后，松扎再灌注60造成的心脏缺血再灌注模型，以心电图监测心律失常情况，主要指标以心律出现失常的时间，持续时间及室性心动过速（VT）、心室颤动（VF）的发生率，ST段在不同再灌注时间的变化。并测定心肌组织SOD、GSH-PX、及MDA、Ca2+的含量变化。试验材料试验动物：Wister大鼠60只，雄雌各半220~240g.试验仪器及用具：心电图机、内切式组织匀浆器、原子吸光光度计、恒流泵、手术台及手术的相关器具、橡皮管和线。药品与试剂：试药复方五加刺注射液（CASI）、乌拉坦、生理盐水、前列腺素E1、MDA、SOD及GSH-PX测定试剂盒、钙标准溶液。试验步骤LD50的测定，取LD50的1/3为试样的最大量。动物分组：将选好的60只大鼠随机分为假手术组、模型组、阳性前列腺素E1mug/kg组和CASIA、B、Cmg/kg组（A=1/2B=1/2C），其中每组10只。心肌缺血再灌注模型的制备：给各组大鼠胸腔注射乌拉坦1g/kg进行麻醉，监测肢体Ⅱ导联心电图，分离气管并插管，开胸后应立即进行人工呼吸机正压呼吸（频率54次/min流量每100g体重2ml).试验步骤假手术组冠状动脉前降肢下穿线不结扎外，其余各组均结扎冠状动脉前降肢。结扎30min后，松解结扎线进行再灌注，时间为60min.在松解的同时，各组均以恒流泵经股静脉匀速输入药物或生理盐水。试验步骤心律失常率及ST波段变化测定：通过心电图机，记录再灌注30min内心律失常出现的时间、持续时间及室性心动过速（VT）、心室颤动（VF）的发生率，并记录15min、30min、60min的ST段时间变化如表1和表2。试验步骤心肌组织匀浆的制备：再灌注60后，各组立即取出心脏，用冰冷生理盐水冲洗、吸干称重后以生理盐水为介质，用内切式组织匀浆机制10%的心肌匀浆组织备用。试验步骤心肌组织生化指标测定SOD、GSH-PX活力及MDA含量均按试剂盒方法测定计算，心肌细胞内Ca含量以Ca标准为标准对照，用原子吸光光度计测定,表3。数据统计方法心律失常发生率用X²检验、其他数据进行组间t检验，所得计量资料均以x±s表示表1，CASI对大鼠心肌缺血再灌注出现心律失常时间、持续时间及发生率（x±sn=10)组别剂量心律失常出现时间持续时间VTVF/㎎·㎏-1/min/min/%/%假手术组模型组CASI前列腺素E1000000--------------------A--------------------B--------------------C---------------------m-----------------------数据统计方法心律失常发生率用X2检验、其他数据进行组间检验，所得计量资料均以x±s表示表2，CASI对大鼠心肌缺血再灌注ST段抬高程度/mv（x±sn=10)组别剂量15min30min60min/㎎·㎏-1假手术组模型组CASI前列腺素E10---------------0---------------A---------------B---------------C---------------m---------------数据统计方法心律失常发生率用X2检验、其他数据进行组间检验，所得计量资料均以x±s表示表3，CASI对大鼠心肌缺血再灌注MDA、Ca2+的含量及SOD、GSH-Px活性的影响（x±sn=10)组别剂量MDACa2+SODGSH-Px/㎎·㎏-1/nmol·ng-1/nmol·l-1/nu·mg-1/u·mg-1假手术组模型组CASI前列腺素E10------------------0------------------A------------------B------------------C------------------m------------------试验结果预测CASI对大鼠缺血再灌注心律失常发生率及出现时间、持续时间的影响：假手术组：未出现任何心律失常现象；模型组：出现心律失常时间短，持续时间长，发生率最高；阳性药物组和CASI组（A、B、C㎎/㎏）：出现心律失常时间延长，持续时间明显缩短，发生率明显下降，与模型组比较有差异性显著。试验结果预测CASI对大鼠缺血再灌注15min、30min、60minST段变化的影响：假手术组：无明显改变；模型组：显著提高；阳性药物组和CASI组（A、B、C㎎/㎏）：应明显降低ST段的抬高程度，与模型组比较有显著性差异。试验结果预测CASI对大鼠缺血再灌注心肌组织中MAD、Ca2﹢含量及SOD、GSH-PX活性的影响：与假手术组相比，模型组的MAD、Ca2﹢含量明显增高，而SOD和GSH-PX活性明显降低。阳性药物组和CASI组（A、B、C㎎/㎏）与模型组相比，MAD、Ca2﹢含量明显降低，而SOD和GSH-PX活性明显提高，有显著性的差异。讨论心肌缺血再灌注损伤所致的严重性心律失常是造成冠心病患者猝死的重要原因，在心肌细胞膜脂质过氧化状态，心肌细胞内Ca2﹢超负等因素在心肌缺血再灌注室性心律失常起着重要的作用，因此抑制细胞膜过氧化的发生，降低细胞内Ca2﹢的含量是防治心肌损伤和降低再灌注心律失常发生的重要途径，也是我们研发该类药物的依据。