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细胞培养（四）暨南大学医学院生物化学教研室费嘉（一）培养细胞污染的判定与排除•污染的定义----按现代的观念，凡是混入培养环境中对细胞生存产生有害的成分和造成细胞不纯的异物都应该视为污染。•污染物的种类微生物（真菌、细菌、病毒和支原体）化学物质（影响细胞生存、非细胞所需的化学成分）细胞（非同种的其他细胞）•污染途径1空气：空气是微生物及尘埃颗粒传播的主要途径。----培养设施不能设在通风场所。-----无菌操作应在净化台内进行，工作时要带口罩，以免因讲话、咳嗽等使外界污染进入操作面，造成污染。超净工作台2器材：各种培养器皿、器械消毒不彻底和洗刷不干净导致污染，另外需要对培养箱进行定期消毒，防止形成污染3操作：o实验操作无菌观念不强o技术不熟练o使用污染的器皿或封瓶不严o培养两种以上细胞时，操作不规范，交叉使用吸管或培养液、培养瓶等导致细胞交叉污染。4血清：有些血清在生产时就已经被支原体或病毒等污染。5组织样本：原代培养的污染多数来源于组织样本；取材时碘酒消毒后脱碘不彻底，可造成碘混入组织、细胞或培养液中，影响细胞细胞生长。污染对培养细胞的影响及污染的检测----体外培养细胞自身没有抗污染能力----培养基中抗生素抗污染能力有限•培养细胞一旦发生污染多数将无法挽回。•细胞污染早期或污染程度较轻时，如果能及时去除污染物，部分细胞有可能恢复•当污染物持续存在培养环境中，轻者细胞生长缓慢，分裂现象减少，细胞变得粗糙，轮廓增强，细胞浆出现颗粒•污染较严重，细胞增殖停止，分裂现象消失，细胞质中出现大量堆积物，细胞变圆、脱壁。（一）细菌污染•常见大肠杆菌、假单孢菌、葡萄球菌等污染。•细菌污染初期由于培养体系的抗生素作用，其繁殖处于抑制状态，细胞生长不受明显影响，污染情况用倒置显微镜观察不易判断。细菌污染的判定方法•转入无抗生素培养基培养（初期）---怀疑培养细胞有细菌污染时，取10ml细胞悬液离心1000rpm5min，沉淀中加入无抗生素培养液2ml，将细胞放培养箱培养。(a)Bacteria.(b)Yeast•培养液外观观察（后期）---细菌污染大多数可以改变培养液pH，使培养液变浑浊、变色。•相差显微镜观察---在相差显微镜下，可见满视野都是点状的细菌颗粒，原来的清晰培养背景变得模糊，大量的细菌甚至可以覆盖细胞，对细胞的生存构成威胁。（二）真菌污染•微生物污染中以真菌最多，真菌种类繁多，形态各异。•真菌生长迅速，能在短时间内抑制细胞生长、产生有毒物质杀死细胞。真菌污染的判定方法•肉眼观察---大多呈白色或浅黄色小点漂浮于培养液表面，肉眼可见•镜下观察---镜下可见呈丝状、管状、树枝状散在生长的真菌，纵横交错穿行于细胞之间。念珠菌和酵母菌卵圆形，散在细胞周边和细胞之间生长。(c)MoldMonilia(念珠菌污染)Burkholderiacepacia（洋葱佰克霍尔德菌）pituitarytumor,fungus(垂体瘤原代培养真菌污染)（三）支原体污染•支原体是一种介于细菌和病毒之间、能独立生活的最小微生物，无细胞壁，形态呈多形形，最小0.2um，可以通过过滤器。•购买的各种血清中常含有支原体。•支原体是细胞培养中最常见的、干扰试验结果的一种污染。支原体污染的判定方法•细胞污染支原体后，并不发生死亡，支原体可以与细胞长期共存，培养基一般不发生浑浊，细胞无明显变化，外观正常。所以单从细胞形态上判定不易。•判定支原体污染，通常是在细胞生长总体状态不佳，且排除了其他污染的情况下，进行怀疑判定。(d)Mycoplasmae&fScanningelectronmicrographofmycoplasmagrowingontheSurfaceofculturedcells（四）细胞交叉污染•细胞间交叉污染能使细胞的生长特性、形态特征等发生变化，有些变化较轻、不易察觉，有些可能由于污染的细胞具有生长优势最终压过原来细胞而导致细胞的生长抑制，最终死亡。细胞交叉污染的判定•观察细胞形态学•分析生长特性和核型•检测细胞的标记物等污染的预防防止污染，预防是关键，预防措施应该贯穿整个细胞培养的始终。•1器皿准备中的预防-----用于细胞培养的器皿应该严格消毒，做到真正洁净；应该无菌的物品，要做到消毒严格、真正无菌；器皿的运输、贮存过程中，要严格操作，谨防污染。•2开始操作前的预防主要包括：定期清洗或更换超净台的空气滤网，定期检查超净台的空气净化标准；有条件的实验室尽量使用一次性细胞培养用品；检查新配置的培养液，确认无菌方可使用；操作前提前半小时启动超净台的紫外灯消毒；操作者应戴口罩，消毒双手。•3操作过程中的预防•主要包括：超净台内放置的所有培养瓶瓶口不能与风向相逆不允许用手触及器皿的无菌部分在安装吸管冒、开启或封闭瓶口操作时要经过酒精灯烧灼，并在火焰附近工作吸取培养液、细胞悬液等液体时，应专管专用使用培养液前，不宜较早开启瓶口，开瓶后的培养瓶应保持斜位，避免直立不再使用的液体应立即封口培养的细胞在处理之前不要过早的暴露空气中操作时不要交谈、咳嗽，以防唾沫和呼出气流引发污染操作完毕后应将工作台面整理好，并消毒擦拭工作面，关闭超净台。•4其他预防：主要有：及早冻存培养物重要的细胞株传代工作应有两个人独立进行购入的未灭活血清一定要进行热灭活处理为了避免诱导抗药细菌，应定期更换培养系统的抗生素，或尽可能不用抗生素对新购入的细胞株应加强观察，防止外来的污染源定期消毒培养箱。污染的排除•良好的无菌操作是技术是控制微生物污染细胞的基础•细胞污染时，应首先找出污染的原因•如果有价值的细胞被污染，并且污染程度较轻，可以通过及时排除污染物，挽救细胞恢复正常。•常用的排除微生物污染的方法有以下几种：1抗生素排除法2加温除菌3与巨噬细胞共培养•1抗生素排除法：是细胞培养中处理细菌污染的主要手段。o抗生素的效用：抑菌、杀菌提倡联合应用和预防性应用•发生微生物污染后再使用抗生素，常难以根除。•反复使用导致微生物耐药性的产生，而且对细胞本身也有一定影响•抗生素的冲击疗法----一些有价值的细胞被污染后，可采用5－10倍于常用量的冲击法，加入高浓度抗生素后作用24－48小时，再换入常规的培养液，有时可以奏效。•2加温除菌：是处理支原体污染的方法，因为支原体的耐热性能较差。将受支原体污染的细胞置于41℃中作用5－10小时（最长可以达18小时）杀灭支原体。•3与巨噬细胞共培养原理：在良好的体外培养条件下巨噬细胞可以存活7－10天，并可以分泌一些细胞因子支持其他细胞的克隆生长。与体内情况相似，巨噬细胞在体外条件下仍然可以吞噬微生物并将其消化。方法：利用96孔板将极少培养细胞与巨噬细胞共培养，可以在高度稀释培养细胞、极大地降低微生物污染程度地同时，更有效地发挥巨噬细胞清除污染地效能。本法与抗生素联合应用效果更佳。