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氨基酸的分离鉴定——纸层析法一、实验目的掌握氨基酸纸层析的方法和原理，学会分析待测样品的氨基酸成分。二、实验原理纸层析是以滤纸为惰性支持物的分配层析。滤纸纤维上的羟基具有亲水性，吸附一层水作为固定相，有机溶剂为流动相。当有机相流经固定相时，物质在两相间不断分配而得到分离。溶质在滤纸上的移动速度用Rf值表示：Rf=原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。三、实验器材（1）大烧杯（5000mL）：1只/组（2）微量注射器（100L）：1只/组。（3）喷雾器：公用。（4）培养皿：1只/组。（5）层析滤纸（长22cm、宽14cm的新华一号滤纸）：1张/组。（6）直尺、铅笔：自备。（7）电吹风：1只/组。（8）托盘、针、白线：1套/组。（9）手套：1双/组。（10）塑料薄膜：公用。（11）小烧杯：50mL，1只/组。四、实验试剂（1）扩展剂：将4体积正丁醇和1体积冰醋酸放入分液漏斗中，与5体积水混合，充分振荡，静置后分层，弃去下层水层。（2）氨基酸溶液：0.5%的已知氨基酸溶液3种（赖氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸），0.5%的待测氨基酸液1种。（3）显色剂：0.1%水合茚三酮正丁醇溶液。实验试剂五、实验操作检查培养皿是否干燥、洁净；若否，将其洗净并置于干燥箱内120℃烘干。（1）平衡：剪一大块塑料薄膜铺在桌面上，将层析缸或大烧杯到置于塑料薄膜上，再把盛有约20mL展层溶液的小烧杯置于倒置的层析缸或大烧杯中，用塑料薄膜密封起来，平衡20min。（2）规划：带上手套，取宽约14cm、高约22cm的层析滤纸一张。在纸的下端距边缘2cm处轻轻用铅笔划一条平行于底边的直线A，在直线上做4个记号，记号之间间隔2cm，这就是原点的位置。另在距左边缘1cm处画一条平行于左边缘的直线B，在B线上以A、B两线的交点为原点标明刻度（以厘米为单位），参见左图。（3）点样：用微量注射器分别取10mL左右的氨基酸样品（每取一个样之前都要用蒸馏水洗涤微量注射器，以免交叉污染），点在这四个位置上。挤一滴点一次，同一位置上需点2～3次，2～3mL/次，每点完一点，立刻用电吹风热风吹干后再点，以保证每点在纸上扩散的直径最大不超过3mm。每人须点4个样，其中3个是已知样，1个是待测样品。（4）层析：用针、线将滤纸缝成筒状，纸的两侧边缘不能接触且要保持平行，参见图3-3。向培养皿中加入扩展剂，使其液面高度达到1cm左右，将点好样的滤纸筒直立于培养皿中（点样的一端在下，扩展剂的液面在A线下约1cm），罩上大烧杯，仍用塑料薄膜密封。当扩展剂上升到A线时开始计时，每隔一定时间测定一下扩展剂上升的高度，填入表3-1中。当上升到15～18cm，取出滤纸，剪断连线，立即用铅笔描出溶剂前沿线，迅速用电吹风热风吹干。（5）显色：用喷雾器在通风厨中向滤纸上均匀喷上0.1%茚三酮正丁醇溶液，然后立即用热风吹干，即可显出各层析斑点，参见左图。（6）计算各种氨基酸的Rf值，并判断混合样品中都有哪些氨基酸，各人将自己的实验结果贴在实验报告上，见表3-2。（7）以层析时间为横坐标，扩展剂上升高度为纵坐标画图，求出扩展剂上升到18cm时所需要的时间。（8）将微量注射器内外用蒸馏水清洗干净，倒掉用过的展层液和平衡液，将培养皿洗净，整理好桌面上的仪器和试剂，并注意清洁自己的操作台，请老师验收，实验报告当场交给老师。计算Rf=原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离记录与计算汇总扩展剂前沿上升速度X（min）0510152030406090…18Y（cm）纸层析结果赖氨酸苯丙氨酸缬氨酸待测氨基酸原点到层析斑点中心的距离原点到溶剂前沿的距离Rf判断待测氨基酸