DNA聚合酶合成DNA模板解链

聚合酶链式反应Polymerasechainreaction（PCR）三峡大学医学院盛德乔[e-mail]1.做什么?2.如何做?3.如何做好？PCR目的PCR——体外（试管内）短时间内扩增获得大量的目的DNA拷贝能够扩增特异的基因短时间内能够扩增至百万倍必需知道部分序列！Polymerasechainreaction(PCR)是由K.Mullis于1983发明的,这项技术通过模拟DNA的复制过程，在体外大量扩增目的DNA片段。PCR技术使我们可以无限制地扩增我们研究的DNA片段，特别是哪些不容易得到的目的DNA片段。TheNobelPrizeinChemistry1993简介KaryB.MullisEnzymaticamplificationofbeta-globingenomicsequencesandrestrictionsiteanalysisfordiagnosisofsicklecellanemia.Science.1985Dec20;230(4732):1350-4DNA复制的关键解链（模板）DNA聚合酶RNA引物模拟DNA复制过程？DNA复制解链（模板）多种酶和蛋白质RNA引物引物酶合成DNA链：DNA聚合酶合成DNA模板解链：变性热、酸、碱引物：退火合成！（RNA/DNA）新DNA链合成：延伸DNA聚合酶耐热DNA聚合酶！问题？1.聚合酶热稳定性？2.自动、程序化处理？PCR基本原理三步曲:变性、退火、延伸类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。PCR的基本反应步骤变性95˚C延伸72˚C退火Tm-5˚C五要素:PCR体系基本组成成分1.模板DNA（Template）2.特异性引物（Primer）3.耐热DNA聚合酶（Taq）4.dNTPs5.Mg2+PCR仪Bio-Rad伯乐美国Eppendorf德国ABI公司ThermoFisher美国引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。实际上，有讲究！引物（Primer）设计引物应遵循以下原则1.引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。2.引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。3.引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。4.避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。5.引物3‘端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。选择G/C为最佳。6.引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。（常用！）7.引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。•引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。如何设计引物？1.手工设计2.PCR引物试剂软件专业软件：Oligo6，PrimerPremier半专业软件：DNAMAN,Dnasis，Omiga，Dnastar3.在线引物设计Primer3::序列左边引物右边引物Primer3参数设置单击Primer3结果输出Primer3结果输出BLAST--BasicLocalAlignmentSearchTool选择物种选择程序Primer-BLASTDNA序列引物参数单击1.设计引物2.引物的特异性引物设计实践请为扩增人IL-2全长cDNA设计引物！找人IL-2基因序列；NCBI/Nucleotide/interleukin-2分析序列;CDS设计引物双链/互补链！CDS56-5171agttccctatcactctctttaatcactactcacagtaacctcaactcctgccacaatgta61caggatgcaactcctgtcttgcattgcactaagtcttgcacttgtcacaaacagtgcacc121tacttcaagttctacaaagaaaacacagctacaactggagcatttactgctggatttaca181gatgattttgaatggaattaataattacaagaatcccaaactcaccaggatgctcacatt241taagttttacatgcccaagaaggccacagaactgaaacatcttcagtgtctagaagaaga301actcaaacctctggaggaagtgctaaatttagctcaaagcaaaaactttcacttaagacc361cagggacttaatcagcaatatcaacgtaatagttctggaactaaagggatctgaaacaac421attcatgtgtgaatatgctgatgagacagcaaccattgtagaatttctgaacagatggat481taccttttgtcaaagcatcatctcaacactgacttgataattaagtgcttcccacttaaa541acatatcaggccttctatttatttaaatatttaaattttatatttattgttgaatgtatg601gtttgctacctattgtaactattattcttaatcttaaaactataaatatggatcttttat661gattctttttgtaagccctaggggctctaaaatggtttcacttatttatcccaaaatatt721tattattatgttgaatgttaaatatagtatctatgtagattggttagtaaaactatttaa781taaatttgataaatataaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa//如何设计引物？Taq酶酶及其浓度目前有两种TaqDNA聚合酶供应：一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶另一种为大肠菌合成的基因工程酶催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。TaKaRaTaqTM（5U/μl）InvitrogenAccuPrime™TaqDNAPolymerase一般TaqDNA聚合酶活性半衰期为92.5℃130min95℃40min97℃5minTaqDNA聚合酶的出错率，一般PCR中出错率为2×10-4核苷酸/每轮循环。（测序？）1.5-2单位的TaqDNA聚合酶就足以进行30轮循环。所用的酶量可根据DNA、引物及其它因素的变化进行适当的增减。酶量过多会使产物非特异性增加，过少则使产量降低。Taq酶特性1.耐热性能2.保真性能3.是否为平末端如何选择？CharacteristicsDescriptionOriginMolecularweightOptimaltemperatureActivityStabilityFidelityMg2+concentrationExonucleaseactivityTransferaseactivityThermusaquaticusstrainYT194kd72--80℃150nucleotides/sec/molecule50%at95℃for40min1.1×10-4substitutionspercycle0.5mM10mM5’to3’only5’adenosinesCharacteristicsofTaqPolymerasedNTPsdNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1MNaOH或1MTris-HCl的缓冲液将其pH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。模板模板（靶基因）核酸——模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。蛋白质污染有机试剂污染Mg2+浓度Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200mmol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，Mg2+浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少。PCR条件优化dNTPs浓度Mg2+浓度pH值Taq用量循环中每一步时间，循环数退火温度加入一些辅助物:PEG、BSA、甲酰胺引物设计PCR循环参数预变性94~95℃/5min循环（25~35）变性94℃/30Sec退火52~60℃/30Sec延伸72℃/30~60Sec延伸72℃/10Min2~3小时完成！PCR扩增产物分析1.凝胶电泳分析（大小？）琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳2.酶切分析3.分子杂交：Southern印迹杂交斑点杂交4.核酸序列分析（突变？）PCR常见问题假阴性，扩增不出特异带假阳性出现非特异性扩增带出现片状拖带或涂抹带几种重要的PCR衍生技术1.反转录PCR技术(RT-PCR)2.原位PCR技术(insitePCR)3.不对称PCRasymmetricPCR4.锚定PCRanchoredPCR5.多重PCRMultiplexPCR6.实时定量PCR技术RealtimePCRRT-PCR1.定义：Reversetranscriptase-PCR（RT-PCR）——即逆转录PCR，是将RNA的逆转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增反应（PCR）相结合的技术。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞组织中基因表达水平、细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列等。2.优点：去除了内含子序列，包含所有的编码序列（表达？）；分子较小，易于操作；半定量。RT-PCRRTPCR步骤：提取样品中的总RNA总RNA用oligo(dT)作引物逆转录成产生cDNA/RNA杂交链用一套特异的引物扩增靶基因。巢式PCR或常规RealtimePCR实时荧光定量PCR技术于1996年由美国AppliedBiosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。实时定量PCR(real-timequantitativePCR)是指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量，不需要取出PCR产物进行分离。扩增与检测分开进行使用荧光染料检测DNA对PCR终点的DNA量进行定性或定量使用凝胶区别不同片断大小的DNA常规PCR的检测方法实时定量PCR的原理相同模板在同一台PCR仪上相同条件下重复96次扩增的扩增曲线图起点定量终点定量终点处检测产物量不恒定起点