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高效液相色谱基础知识高效液相色谱基础知识高效液相色谱基础知识高效液相色谱基础知识天美科技液相培训教材（一）第一章第一章液相色谱基础液相色谱基础本章内容本章内容液相色谱发展史液相色谱理论分离原理•分离原理•分类•基本概念•理论模型常见的分离方式常见的分离方式第一章液相色谱基础常见的分离方式常见的分离方式蒸馏离心离心电泳电泳过滤超滤色谱色谱第一章液相色谱基础色谱法的分类色谱液相色谱气相色谱柱色谱纸色谱薄层色谱高效液相色谱液相色谱第一章液相色谱基础液相色谱发展史z1906年-色谱法出现1906年色谱法出现z1940's-分配色谱和纸色谱z1950's-气相色谱、薄层色谱、凝胶过滤色谱、梯度洗脱色谱'商品化液相色谱z1960's-商品化液相色谱z1980's-HPLC迅速发展z1980s-HPLC迅速发展第一章液相色谱基础传统柱色谱传统的柱色谱以重力做为溶剂传输的动力分离输的动力，分离速度慢，效率低，且靠肉眼观察化合物的分离和流合物的分离和流出，具有很大的局限性。第一章液相色谱基础分离原理分离是一个物理的过程利用物质在两相中分配系数的微小差异，当两相作相对移动时，使被测物质在两相之间进行反复多次分配，这样使原来的微小分配差异产生了很大的效果使各组分分离生了很大的效果，使各组分分离。第一章液相色谱基础液相色谱分类根据分离机制¾吸附根据流动相与固定相极性正相¾吸附¾分配离子交换正相反相¾离子交换¾亲和色谱正相色谱法极性固定相，流动相为相反相色谱法非极性固定相（如C18、C8）流动相为水或缓冲液适用于分离对非极性的疏水性溶剂，常用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。C8），流动相为水或缓冲液，适用于分离非极性和极性较弱的化合物，它占整个HPLC应用的80%左右。基本概念和术语第一章液相色谱基础基本概念和术语时间（分钟）时间（分钟）色谱图:色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图其纵坐标为信号强度横坐标为保留时间的曲线图,其纵坐标为信号强度,横坐标为保留时间.第一章液相色谱基础基本概念和术语色谱峰:色谱柱流出组分检产通过检测器时产生的响应信号的微分曲线H=峰高W=峰宽Wh/2=半峰宽Wh/2=半峰宽tM=死时间tR=保留时间tR'=相对保留时间tR'=相对保留时间死时间的测定通常是使用不被柱子保留而又有紫外吸收的惰性物质死时间的测定通常是使用不被柱子保留而又有紫外吸收的惰性物质.例如：正相色谱常用四氯化碳;反相色谱常用甲醇、尿嘧啶、NaNO3等。第二章第二章HPLCHPLC仪器工作原理仪器工作原理本章内容¾HPLC特点¾HPLC系统的组成¾HPLC系统的组成¾往复活塞泵工作原理¾手动进样器结构及工作原理¾常见检测器第二章第二章HPLCHPLC仪器工作原理仪器工作原理HPLC特点又称为“高速液相色谱”或“高压液相色又称为高速液相色谱或高压液相色谱”高速–高速–高效–高灵敏度–高自动化–高自动化C系统的组成第二章第二章HPLCHPLC仪器工作原理仪器工作原理HPLC系统的组成•典型高效液相色谱仪–主要部分：•高压输液系统•进样系统•进样系统•分离系统•检测系统第二章第二章HPLCHPLC仪器工作原理仪器工作原理输液系统z恒压泵恒流泵输液系统中的关键部位z恒压泵，恒流泵输液系统中的关键部位z柱塞杆z密封圈z密封圈z单向阀往复型泵工作原理图第二章第二章HPLCHPLC仪器工作原理仪器工作原理并联式双柱塞往复泵•相消干扰•通常需要阻尼器•增加了单向阀的使增加了单向阀的使用数量第二章第二章HPLCHPLC仪器工作原理仪器工作原理串联式双柱塞往复泵-减少了单向阀的数量减少了单向阀的数量第二章第二章HPLCHPLC仪器工作原理仪器工作原理梯度模式第二章第二章HPLCHPLC仪器工作原理仪器工作原理进样装置HITACHIL2200自动进样器7725I手动进样器HITACHIL-2200自动进样器第二章第二章HPLCHPLC仪器工作原理仪器工作原理L-2200自动进样器直接进样示意图直接进样示意图第二章第二章HPLCHPLC仪器工作原理仪器工作原理7725I六通阀检测器第二章第二章HPLCHPLC仪器工作原理仪器工作原理检测器作用：把洗脱液中组分的量转变为电信号•紫外-可见检测器•二极管阵列检测器•示差检测器•示差检测器•荧光检测器•电导检测器质谱检测器•质谱检测器•其它第二章第二章HPLCHPLC仪器工作原理仪器工作原理第三章第三章液相色谱的方法开发液相色谱的方法开发第三章第三章液相色谱的方法开发液相色谱的方法开发分离方法第三章方法开发液相色谱的应用分析型液相色谱（定性及定量分析）制备型液相色谱（分离及纯化）（定性及定量分析）（分离及纯化）✎灵敏度的要求✎样品的复杂性✎化合物的稳定性✎样品的复杂性✎样品量的要求✎精度及准确度的要求✎制备量的要求✎纯度的要求及鉴定✎容易使用度的要求及定✎方法的安全性第三章方法开发开发液相色谱方法液相色谱实验所需的基本参数:✔流动相:种类及配比(等度或梯度)流动相种类及配(等度或梯度)✔固定相:色谱柱类型及内径,长短✔流动相输送系统参数:流速动输系数✔检测器参数:检测波长,灵敏度等✔温度控制制✔进样量以上参数即构成一个具体的HPLC方法,亦称色谱条件第三章方法开发评价液相色谱方法的标准第三章方法开发分离度tR(B)ABRRttR－＝)(2tR(A)BAABWWRRSttR＋＝)(jectSampleASampleBt0InW1/2AW1/2BSampleBTimeWAWB1/2BAB第三章方法开发影响分离度的因素：K',α,N分离度的方程✎k'：容量因子，表达了被分离组分与柱填料的作用强弱。✎α：分离因子，描述两个组分分离的好坏程度，化学因素。✎N：理论塔板数，描述色谱峰的谱带展宽程度。第三章方法开发容量因子容量因子k'k'定义定义0ttkR－或溶质在固定相中的量00,tkR＝或：溶质在流动相中的量溶质在固定相中的量＝'k性质与柱子的大小及流速无关只与溶质在固定相和流动相的分配性与柱子的大小及流速无关，只与溶质在固定相和流动相的分配性质、柱温以及相空间比（即固定相和流动相之体企积比）有关。又定义为在分配平衡时某溶质在两相中绝对量之比，消除了保留值的波动因素值的波动因素。范围0.4＜k'＜20～30范围0.4k2030第三章方法开发容量因子容量因子k'k'与峰高的关系与R的关系改变k'值的方法改变k值的方法✎调节流动相的极性、pH、离子强度等✎梯度淋洗✎梯度淋洗第三章方法开发选择性系数选择性系数αα定义)2()2(''ktR＝α＝)1()1(''ktR改变α的途径✎改变固定相✎改变固定相✎改变流动相✎改变温度✎改变温度✎改变样品的本身性质第三章方法开发色谱柱的柱效N理论塔板数计算公式2545⎟⎞⎜⎛RtN2/54.5⎟⎟⎠⎜⎜⎝hRWN＝216⎟⎠⎞⎜⎝⎛WtNR＝⎟⎠⎜⎝W第三章方法开发提高柱效的方法塔板数N主要取决于色谱柱本身质量✎减小填料的颗粒度✎找到昀佳的流速(根据不同内径)✎合适的温度合适的温度✎降低溶剂的粘度增加柱长✎增加柱长第三章方法开发其他影响柱效的因素柱外效应✎连接管路✎进样器检测器进样体积进样量进样量第三章方法开发影响分离度（R）值的因素第三章方法开发不同R值的峰重叠示意图R1.5可以得到基线分离第三章方法开发开发液相色谱方法❀分辨率是色谱分离中主要考虑的因素❀在开发色谱方法时有很多因素是很重要的除分辨率❀在开发色谱方法时有很多因素是很重要的除分辨率之外以下几个因素都要考虑✎灵敏度✎成本✎载样量✎容易使用✎载样量✎容易使用✎分析速度✎色谱柱寿命✎溶剂损耗✎效率✎溶剂损耗✎效率第三章方法开发第一步干什么?•想办法得到各种信息–向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样品的分析方法–查文献，如CA(化学文摘)–仪器制造商的文献对色谱柱有足够的了解•对色谱柱有足够的了解–掌握分离机理，自己开发方法•充分了解您自己的样品•充分了解您自己的样品第三章方法开发分析时要了解哪方面的情况？•灵敏度的要求有多高?•样品的本底是否很复杂?•有多少组份要分析?•有多少组份要分析?•对分析的精确度、准确度等有多高要求?•是否因是日常检验，而要求方法容易使用?第三章方法开发分离时要了解哪方面的情况？•要分离（即制备）的样品量有多大?•要分离的组份在样品中的含量很高?还是微量?•是否需要保持生物活性?•对分离产物纯度的要求有多高?•对分离产物纯度的要求有多高?•纯度或活性的鉴定如何完成?第三章方法开发一般的具体步骤•先用一根短的色谱柱•用相对较高的流速•使用尽可能纯度高的标准品•先用高强度的洗脱液•调节k’值改变保留值•调节α值改变选择性值改择•调节柱长度改变柱效及分离速度请记住∶每次改变一个参数每次变个参数第三章方法开发使用文献方法•色谱柱填料的种类、品牌是否相同?•注意文献方法的流动相–是否损害色谱柱?–如色谱填料品牌不同，需要调整流动相注意色谱柱的规格内径柱长•注意色谱柱的规格：内径、柱长–需要调整流速、进样量•注意梯度条件•注意梯度条件•了解系统的滞后体积（梯度）第三章方法开发色谱方法转换如果没有与文献或要求相近的色谱柱•如果没有与文献或要求相近的色谱柱转换进样量LD2)(–转换进样量进样量初始初始现在现在初始×=LDLDLoadLoad2)()()(长度内径，==LD–转换流速流速现在初始×=DDFF22)()()(内径初始初始=DD2)(第三章方法开发反相色谱的方法开发开发过程实例•开发过程实例–色谱条件∶色谱柱¾色谱柱：C18，4.6mm×250mm¾流动相：乙腈/水，不同的溶剂强度，60/4050/5040/60由强渐弱60/40、50/50、40/60，由强渐弱¾流速：1.5ml/min–样品：样品：①对羟基苯甲酸甲酯(MethylParaben)②对羟基苯甲酸丙酯(PropylParaben)③对羟基苯甲酸丁酯(ButylParaben)第三章方法开发改变容量因子K'①①①谱图50/5040/60②②③②②③③③60/40改变选择性∶α第三章方法开发改变选择性∶α•通过改变流动相改变选择性通过改变流动相改变选择性–同样强度的不同溶剂42:58/72:28/22，②，①OHMeOHOHTHF62:38/232，③OHCNCH①②③①改变色谱柱•改变色谱柱第三章方法开发方法开发的其他因素•流速对柱效的影响不同内径的色谱柱有自己的昀佳流速•样品的进样量(浓度)对柱效的影响样品的进样量(浓度)对柱效的影响•样品的进样体积对柱效的影响溶剂粘度对柱效的影响•溶剂粘度对柱效的影响以上因素均影响分离度第三章方法开发方法开发结论•充分用已知样品结构确定以哪种方法开始–普通反相?离子抑制?离子对?还是其他•观察流动相条件改变时色谱峰的移动–根据变化的方向及大小决定下一步干什么•改变参数时要合理，每次只改动其中一个变量！•色谱柱的改变影响昀大第四章第四章流动相及样品的预处理流动相及样品的预处理主要内容液相色谱对流动相的要求液相色谱对流动相的要求流动相的脱气样品的预处理9目的9重要性9常用方法9新方法9新方法液相色谱对流动相的要求第四章流动相及样品的前处理液相色谱对流动相的要求除色谱柱对流动相对的要求外，还有∶与检测器匹配脱气避免卤素离子（不锈钢系统）避免卤素离子（不锈钢系统）溶剂的粘度细菌的生长细菌的生长 流动相的脱气第四章流动相及样品的前处理流动相的脱气流动相脱气的目的流动相脱气的目的使色谱泵的输液准确使色谱泵的输液准确•输液均匀准确，并且脉动减小•保留时间及色谱峰面积的重现性提高提高检测的性能•防止气泡引起的尖峰基线稳定信比增加•基线稳定，信噪比增加•溶剂的紫外吸收本底降低保护色谱柱保护色谱柱•减少死体积•防止填料的氧化防止填料的氧化流动相脱气的方法脱气的方法第四章流动相及样品的前处理流动相脱气的方法脱气的方法加热加热9简单，如同抽真空一起使用，其效果很好。但容易造成流动相组成的变化成的变化抽真空9同上