20160425-Cre-loxP、CRISPR-Cas9技术与病毒载体在基因敲除中的联用

Cre-loxP、CRISPR-Cas9技术与病毒载体在基因敲除中的联用2016-04-25Content第一节、Cre-loxP技术第二节、CRISPR-Cas9技术第三节、病毒工具简介第四节、组合应用示例基因操作技术一览Cre蛋白于1981年从P1噬菌体中被发现，属于λInt酶超基因家族。Cre重组酶基因编码区序列全长1029bp,编码343个氨基酸,38kDa,单体蛋白。Cre重组酶不仅具有催化活性，而且与限制酶相似，能特异地在两个loxP位点间发生基因重组。Cre重组酶无需借助任何辅助因子，可作用于多种结构的DNA底物，如线形、环状甚至超螺旋DNA。loxP位点，是locusofX-overP1的缩写，来自P1噬菌体。间隔序列决定loxP的方向，如下所示：1.Cre-loxP技术简介13bp8bp13bpATAACTTCGTATA-NNNTANNN-TATACGAAGTTATCyclizationrecombinase1.1Cre-loxP技术基本原理1.2Cre-loxP技术应用启动子靶组织或细胞albumin肝脏insulin胰岛b细胞adiposeprotein2脂肪细胞b-lactoglobin乳腺keratin5皮肤musclecreatinekinase骨骼肌myosin心脏protamine-1精子CD19B淋巴细胞proximallckT淋巴细胞Wnt-1orengrailed-2神经系统与组织特异性启动子结合应用，实现Cre转基因的空间控制1.2Cre-loxP技术应用——组织特异性应用启动子诱导物Cre表达的靶组织Mx1IFN肝脏、免疫细胞CMV-tTAtetracycline广泛表达CMV-ERtamoxifen广泛表达与诱导性表达启动子结合应用，对Cre转基因的表达进行控制—MerCreMer重组蛋白1.2Cre-loxP技术应用——可诱导性应用1.3Cre-loxP技术仍有不足之处传统的基因打靶技术主要依赖于基因同源重组，利用设计的同源臂替代靶基因片段，从而达到目的。但是同源重组在细胞中的发生概率极低，而且步骤比较复杂、耗时间、费用也比较高。非同源末端连接（nonhomologousendjoining,NHEJ）2.CRISPR-Cas9技术均由自然界存在的核酸酶系统改造而来均具有识别核酸碱基特异性的结构域作用机制：均通过在细胞基因组创造双链断裂缺口，从而诱发细胞自身修复机制完成基因修饰新3代基因组编辑工具2.1CRISPR-Cas9技术来源N代表任意DNA碱基GuideRNA:crRNA（CRISPR-derivedRNA）通过碱基配对与tracrRNA（trans-activatingcrRNA）结合形成tracrRNA/crRNA复合物。通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA（shortguideRNA）Cas9:复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。HNH结构域剪切配对的部分，Ruvc结构域剪切未配对的链。DNA、RNA和蛋白质聚合物2.2CRISPR-Cas9系统组成1.靶基因分析：明确CDS外显子部分；2.sgRNA位点设计：确定待敲除位点，对于蛋白编码基因，如果该蛋白具有重要结构功能域，可考虑将基因敲除位点设计在编码该结构域的外显子；如果不能确定基因产物性质，可选择将待敲除位点放在起始密码子ATG后的外显子上。如果是microRNA，可以将待敲除位点设计在编码成熟microRNA的外显子或在编码成熟microRNA的外显子的5’和3’侧翼序列。3.Cas9载体构建：根据sgRNA序列，设计引物，合成带粘性末端的双链片段。对表达载体先进行限制性内切酶酶切，得到线性化载体，再把前面得到的双链片段连接入表达载体。再进行感受态细胞的转化和阳性转化子的鉴定；4.Cas9载体活性检测：转染细胞，采用特异性片段扩增后进行的T7E1酶切处理，进行重组效率的检测。2.3CRISPR-Cas9技术流程1.CRISPR-Cas9系统的可用位点更多：理论上基因组中每8个碱基就能找到一个可用CRISPR-Cas9进行编辑的位点，而TALEN和ZFN系统则在数百甚至上千个碱基中才能找到一个可用位点；2.CRISPR-Cas9系统更具有可拓展性：例如可以通过对Cas9蛋白的修饰，让它不切断DNA双链，而只是切开单链，这样可以大大降低切开双链后带来的非同源末端连接造成的染色体变异风险；此外还可以将Cas9蛋白连接其他功能蛋白，从而在特定DNA序列上研究这些蛋白对细胞的影响；3.CRISPR-Cas9系统的使用极为方便，只需要简单的几步就能完成，几乎任何实验室都可以开展工作，因此省时省力；4.可同时对多个基因进行操作而ZFNs和TALEN两项技术则难以实现这种效果。5.多种功能性蛋白都可以通过与Cas9蛋白融合，然后利用gRNA的靶向作用结合到dsDNA的任意位点，发挥人们预期的功能。2.4CRISPR-Cas9技术优势3.病毒载体3.1病毒载体比较3.1病毒载体比较组成型启动子-感染特性决定表达分布3.2病毒载体应用特异性启动子-空间和时间精细表达3.2病毒载体应用4组合应用示例——Cre-loxP与病毒工具结合“条件性基因激活”模式4.1Cre-loxP与病毒工具结合应用4.1Cre-loxP与病毒工具结合应用B4.2Cas9系统与病毒工具结合应用4.2Cas9系统与病毒工具结合应用4.3Cre-loxP、CRISPR-Cas9与病毒结合应用Cre-dependentCas9mice思考题阐述Cre-LoxP技术的基本原理和程序。CRISPR-Cas9技术与ZFN、TALEN相比均有哪些优势？举例说明CRISPR-Cas9技术与病毒工具的组合应用。