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紫外分光光度计的使用原理和方法紫外-可见吸收光谱朗伯-比耳定律紫外-可见分光光度计分析条件的选择测定方法在医学检验中的应用紫外-可见分光光度法(ultraviolet-visiblespectrophotometry,UV-VIS)按所吸收光的波长区域不同，分为紫外分光光度法和可见分光光度法，合称为紫外-可见分光光度法。它是利用物质的分子或离子对某一波长范围的光的吸收作用，对物质进行定性分析、定量分析及结构分析,所依据的光谱是分子或离子吸收入射光中特定波长的光而产生的吸收光谱。紫外-可见分光光度法的特点：1与其它光谱分析方法相比，其仪器设备和操作都比较简单，费用少，分析速度快;2灵敏度高;3选择性好;4精密度和准确度较高;5用途广泛。§1.紫外-可见吸收光谱1.物质对光的选择性吸收物质对光的吸收是选择性的，利用被测物质对某波长的光的吸收来了解物质的特性，这就是光谱法的基础。通过测定被测物质对不同波长的光的吸收强度（吸光度），以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，得出该物质在测定波长范围的吸收曲线。如图3-1；在吸收曲线中，通常选用最大吸收波长λmax进行物质含量的测定。2有机化合物的紫外-可见吸收光谱与紫外-可见吸收光谱有关的电子有三种，即形成单键的σ电子、形成双键的π电子以及未参与成键的n电子。跃迁类型有：σσ*、nσ*、ππ*、nπ*四种。2.1有机化合物的电子跃迁饱合有机化合物的电子跃迁类型为σ→σ*，n→σ*跃迁，吸收峰一般出现在真空紫外区，吸收峰低于200nm，实际应用价值不大。不饱合机化合物的电子跃迁类型为n→π*，π→π*跃迁，吸收峰一般大于200nm。生色团：是指分子中可以吸收光子而产生电子跃迁的原子基团。人们通常将能吸收紫外、可见光的原子团或结构系统定义为生色团。见表3-1和3-2。助色团：是指带有非键电子对的基团，如-OH、-OR、-NHR、-SH、-Cl、-Br、-I等，它们本身不能吸收大于200nm的光，但是当它们与生色团相连时，会使生色团的吸收峰向长波方向移动，并且增加其吸收强度。见表3-4。红移和紫移在有机化合物中，常常因取代基的变更或溶剂的改变，使其吸收带的最大吸收波长λmax发生移动。向长波方向移动称为红移(表3-3)，向短波方向移动称为紫移。2.2有机化合物的吸收带吸收带(absorptionband):在紫外光谱中，吸收峰在光谱中的波带位置。根据电子及分子轨道的种类，可将吸收带分为四种类型。(1)R吸收带(2)K吸收带(3)B吸收带(4)E吸收带3无机化合物的紫外-可见吸收光谱镧系和锕系元素的离子对紫外和可见光的吸收是基于内层f电子的跃迁而产生的。其紫外可见光谱为一些狭长的特征吸收峰，这些峰几乎不受金属离子的配位环境的影响。1.f电子跃迁吸收光谱过渡金属的电子跃迁类型为d电子在不同d轨道间的跃迁，吸收紫外或可见光谱。这些峰强烈受配位环境的影响。例如cu2+以水为配位体，吸收峰在794nm处，而以氨为配位体，吸收峰在663nm处。此类光谱吸收强度弱，较少用于定量分析。2.d电子跃迁吸收光谱3.电荷迁移光谱某些分子既是电子给体，又是电子受体，当电子受辐射能激发从给体外层轨道向受体跃迁时，就会产生较强的吸收，这种光谱称为电荷迁移光谱。如苯酰基取代物在光作用下的异构反应。1.4影响紫外-可见吸收光谱的因素物质的吸收光谱与测定条件有密切的关系。测定条件（温度、溶剂极性、pH等）不同，吸收光谱的形状、吸收峰的位置、吸收强度等都可能发生变化。1.温度在室温范围内，温度对吸收光谱的影响不大。2.溶剂注意如下几点：（1）尽量选用低极性溶剂；（2）能很好地溶解被测物，并且形成的溶液具有良好的化学和光化学稳定性；（3）溶剂在样品的吸收光谱区无明显吸收。3.pH值1.5紫外-可见吸收光谱的应用紫外-可见吸收光谱除主要可用于物质的定量分析外，还可以用于物质的定性分析、纯度鉴定、结构分析。1.定性分析2.纯度的鉴定用紫外吸收光谱确定试样的纯度是比较方便的。如蛋白质与核酸的纯度分析中，可用A280/A260的比值，鉴定其纯度。3.结构分析紫外-可见吸收光谱一般不用于化合物的结构分析，但利用紫外吸收光谱鉴定化合物中的共轭结构和芳环结构还是有一定价值。例如，某化合物在近紫外区内无吸收，说明该物质无共轭结构和芳香结构。§2.朗伯-比尔定律设入射光强度为I0，吸收光强度为Ia,透射光强度为It，反射光强度为Ir，则I0=Ia+It+Ir由于反射光强度基本相同，其影响可相互抵消，上式可简化为：I0=Ia+It一、吸光度和透光度吸光度:为透光度倒数的对数，用A表示，即A=lg1/T=lgI0/It透光度：透光度为透过光的强度It与入射光强度I0之比，用T表示：即T=It/I0二、朗伯-比尔定律朗伯-比尔定律：当一束平行单色光通过含有吸光物质的稀溶液时，溶液的吸光度与吸光物质浓度、液层厚度乘积成正比，即A=κcl式中比例常数κ与吸光物质的本性，入射光波长及温度等因素有关。c为吸光物质浓度，l为透光液层厚度。朗伯-比尔定律是紫外-可见分光光度法的理论基础。三、吸光系数当l以cm，c以g/L为单位，κ称为吸光系数，用a表示。A=acla的单位为L/(g.cm)当l以cm，c以mol/L为单位，κ称为摩尔吸光系数，用ε表示。ε的单位为L/mol.cm，它表示物质的浓度为1mol/L，液层厚度为1cm时，溶液的吸光度。摩尔吸光系数比吸光系数比吸光系数是指百分含量为1%，l为1cm时的吸光度值，用表示。%11cmE%111.0cmrEM四、偏离朗伯-比耳定律的因素（1）入射光为非单色光（3）光程的不一致性。光源不是点光源，比色皿光径长度不一致，光学元件的缺陷引起的多次反射等，均造成光径不一致，从而与定律偏离。（2）溶液的不均性。实际样品的混浊，加入的保护胶体，蒸馏水中的微生物，存在散射以及共振发射等，均可吸光质点的吸光特性变化大。§3.紫外-可见分光光度计一、主要部件的性能与作用基本结构:光源→单色器→吸收池→检测器→信号显示系统↑样品在紫外可见分光光度计中，常用的光源有两类：热辐射光源和气体放电光源1光源热辐射光源用于可见光区，如钨灯和卤钨灯；气体放电光源用于紫外光区，如氢灯和氘灯。单色器的主要组成：入射狭缝、出射狭缝、色散元件和准直镜等部分。2单色器单色器质量的优劣，主要决定于色散元件的质量。色散元件常用棱镜和光栅。吸收池又称比色皿或比色杯，按材料可分为玻璃吸收池和石英吸收池，前者不能用于紫外区。3吸收池吸收池的种类很多，其光径可在0.1~10cm之间，其中以1cm光径吸收池最为常用。4检测器检测器的作用是检测光信号，并将光信号转变为电信号。现今使用的分光光度计大多采用光电管或光电倍增管作为检测器。5信号显示系统常用的信号显示装置有直读检流计，电位调节指零装置，以及自动记录和数字显示装置等。二、紫外-可见分光光度计的类型按其光学系统可分为单波长分光光度计和双波长分光光度计。1.单波长单光束分光光度计目前国内广泛采用721型分光光度计。具有结构简单、价格低廉、操作方便、维修也比较容易，适用于常规分析。单波长单光束分光光度计还有国产751型、XG-125型、英国SP500型和伯克曼DU-8型等。2.单波长双光束分光光度计单波长双光束分光光度计有国产710型、730型、740型、日立UV-340型等就属于这种类型。3.双波长分光光度计双波长分光光度计的优点：是可以在有背景干忧或共存组分吸收干忧的情况下对某组分进行定量测定。国产WFZ800-5型、岛津UV-260型、UV-265型等。三、分光光度计的校正和检验1.波长校正2.吸光度校正3.杂散光的检验4.稳定性的检验§4分析条件的选择一、仪器测量条件的选择1.适宜的吸光度范围由朗伯-比尔定律可知：A=lg1/T=εcl微分后得：dlgT=0.4343dT/T=-εldc或0.4343ΔT/T=-εlΔc代入朗伯-比尔定律有：Δc/c=0.4343ΔT/TlgT要使测定的相对误差Δc/c最小，求导取极小得出：lgT=-0.4343=A即当A=0.4343时，吸光度测量误差最小。最适宜的测量范围为0.2~0.8之间。通常是根据被测组分的吸收光谱，选择最强吸收带的最大吸收波长为入射波长。当最强吸收峰的峰形比较尖锐时，往往选用吸收稍低，峰形稍平坦的次强峰或肩峰进行测定。2.入射光波长的选择3．狭缝宽度的选择为了选择合适的狭缝宽度，应以减少狭缝宽度时试样的吸光度不再增加为准。一般来说，狭缝宽度大约是试样吸收峰半宽度的十分之一。对多种物质进行测定，常利用显色反应将被测组分转变为在一定波长范围有吸收的物质。常见的显色反应有配位反应、氧化还原反应等。二、显色反应条件的选择这些显色反应，必须满足以下条件：4.反应生成物的组成恒定。3.反应生成的产物有足够的稳定性，以保证测量过程中溶液的吸光度不变；2．反应有较高的选择性，即被测组分生成的化合物吸收曲线应与共存物质的吸收光谱有明显的差别；1．反应的生成物必须在紫外-可见光区有较强的吸光能力，即摩尔吸光系数较大；1．酸度显色反应最适宜的酸度范围可通过实验来确定：测定某一固定浓度的试样的吸光度随酸度的变化，以吸光度为纵坐标，溶液的PH值为横坐标作图。3.显色时间和温度2.显色剂的用量测定试样溶液的吸光度，需先用参比溶液调节透光度（吸光度为0）为100%，以消除其它成分及吸光池和溶剂等对光的反射和吸收带来的测定误差。三、参比溶液的选择参比溶液的选择视分析体系而定，具体有：1．溶剂参比试样简单、共存其它成分对测定波长吸收弱，只考虑消除溶剂与吸收池等因素；2．试样参比如果试样基体溶液在测定波长有吸收，而显色剂不与试样基体显色时，可按与显色反应相同的条件处理试样，只是不加入显色剂。3．试剂参比如果显色剂或其它试剂在测定波长有吸收，按显色反应相同的条件，不加入试样，同样加入试剂和溶剂作为参比溶液。4.平行操作参比用不含被测组分的试样，在相同的条件下与被测试样同时进行处理，由此得到平行操作参比溶液。§5测定方法一、单组分定量方法单组分是指样品溶液中含有一种组分，或者是在混合物溶液中待测组分的吸收峰与其他共有物质的吸收峰无重叠。其定量方法包括校准曲线法、标准对比法和吸收系数法。1校准曲线法方法：配制一系列不同含量的标准溶液，选用适宜的参比，在相同的条件下，测定系列标准溶液的吸光度，作A-c曲线，即标准曲线，也可用最小二乘数处理，得线性回归方程。在相同条件下测定未知试样的吸光度，从标准曲线上就可以找到与之对应的未知试样的浓度。2标准对比法即将待测溶液与某一标样溶液，在相同的条件下，测定各自的吸光度，建立朗伯-比尔定律，解方程求出未知样浓度与含量。As=KcsAx=KcxsxsxAAcc例1.血清铜的测定例2.新生儿血清胆红素的测定§6紫外-可见分光光度法在医学检验中的应用