蛋白质的定量测定---考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度【实验原理】考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度,是利用蛋白质-染料结合的原理。考马斯亮蓝G-250染料,在酸性溶液时呈茶棕色,最大吸收峰在465nm。当与蛋白质结合后变成深蓝色,最大吸收峰转至595nm,且其光吸收值与蛋白质含量(10~100μg/ml蛋白质浓度)成正比,因此可用于蛋白质的定量测定。(蓝色)变为氨基酸芳香族碱性染料考马斯亮蓝磷酸nmG595250max该方法灵敏度高,其最低蛋白质检测量可达1μg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大,蛋白质-染料复合物有更高的消光系数,因而光吸收值随蛋白质浓度改变的变化很大。由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。【实验准备】一、试剂(1)考马斯亮蓝试剂:称取考马斯亮蓝G-250100mg溶于50ml95%乙醇中,加入100ml85%磷酸,用蒸馏水稀释至1000ml。(2)生理盐水:0.9%NaCl溶液。(3)标准蛋白质溶液:牛血清蛋白(BSA),用0.9%NaCl稀释成0.1mg/ml蛋白标准溶液。二、器材:试管和试管架、紫外分光光度计、移液枪、漩涡振荡器【实验步骤】一、制作标准曲线取7支干燥洁净的试管,编号按下表加入试剂编号0123456标准蛋白质溶液/ml00.10.20.40.60.81.0生理盐水/ml10.90.80.60.40.20考马斯亮蓝试剂/ml5555555各管加入试剂立即置于漩涡振荡器上混匀后,静置5min,以0号管为空白管调零,在595nm波长下分别测定各管溶液的吸光度值(A595值),如下表所示。编号蛋白浓度(ug/mL)吸光度(A595)1100.1522200.1993400.3324600.4575800.57161000.667以吸光度(A595值)为纵坐标,标准蛋白质浓度(mg/ml)为横坐标,进行直线拟合,得到标准曲线,如y=0.0059X+0.093,R2=0.9975(注:一般相关系数应在0.995以上,至少2个9以上)。考马斯亮蓝标曲y=0.0059x+0.093R2=0.9975y=0.0059x+0.093R2=0.997500.10.20.30.40.50.60.70.8020406080100120浓度(μg/mL)A595A595线性(A595)线性(A595)二、蛋白质含量的测定:样品即所测蛋白质含量样品(含量应处理在所测范围内),依照标准曲线操作,测出样品的A595nm,然后利用标准曲线对应回归方程求出样品蛋白质含量。一般被测样品的A595nm值在0.2-0.8之间,所以上述样品如果A595nm值太大,可以稀释后再测A595nm值,然后再计算。【注意事项】:1、玻璃仪器要洗净且干燥,确保无蛋白质、SDS、Tris、乙酸、2-巯基乙醇、EDTA及微量的去污剂如TritonX-100等污染或干扰实验结果。2、测定完后用乙醇将玻璃比色皿清洗干净。3、所测样品的A595nm值应在0.2-0.8之间,否则需要稀释后检测。4、必须在试剂加入后的5~20min内测定光吸收,因为在这段时间内颜色是最稳定的。5、每次配制考马斯亮蓝染色液后都需要制作标准曲线。