蛋白质纯化工艺简介

蛋白质纯化工艺简介2009-05-1413:40Downstream（下游）与上游相对的概念，一般而言，上游指基因克隆、细胞培养等目的产物表达工序，下游指从表达有目的产物的复杂的混合液中分离纯化得到符合要求的目的产物的一系列步骤。美、日、欧等发达国家生物技术产品工业化的实践证明：生物技术产品的产业化高度依赖于基因工程下游工序技术及设备的进步。一、纯化工艺常用衔接技术：1、盐析。常采用硫酸铵、硫酸钠盐析，获得的盐析沉淀物在低温冰箱(-20℃)中可以长期保存。2、等电点沉淀。根据蛋白质、多肽在等电点时溶解度最小的特点进行。3、有机溶剂沉淀。采用冷的丙酮、乙醇沉淀蛋白质。例如人血浆蛋白的乙醇分级沉淀。4、透析。根据目的蛋白质、多肽的分子量，选取适宜的透析袋进行透析，可以起到更换缓冲液以及去除一些低分子杂质的目的。5、超滤。根据目的蛋白质、多肽的分子量，选取适宜截留分子量(MWcutoff)的超滤膜进行超滤。6、真空冷冻干燥。利用在低温和高真空条件下，冰不经融化为液态水而直接升华为水蒸气的原理。可以很好地浓缩样品和保存蛋白质、多肽的生物活性。7、变性沉淀。根据目的蛋白质、多肽对于温度或者酸碱性的耐受性，在较高的温度或者较极端的pH条件下处理样品，使杂质去除的方法。例如胸腺肽制备中使用的热变性(~80℃)去除杂蛋白。如果目的蛋白、多肽本身热稳定性、酸碱稳定性不高则不宜采用。8、离心沉淀。利用离心沉降力将不溶性颗粒物与溶液分离的技术，常采用高速冷冻离心机进行。9、脱盐。透析、超滤可用于进行脱盐，SephadexG25、G50常用于蛋白质脱盐。10、过滤澄清过滤、除菌过滤（0.22微米膜过滤）、超滤（1000~300000道尔顿）二、蛋白质、多肽液相色谱纯化方法简介chromatography，色谱，层析表1常用的液相色谱纯化方法及其原理方法分离原理基于凝胶过滤（GF）分子大小/形状分子形态离子交换色谱（IEX）分子所带电荷Asp、Glu、Lys、Arg、His等带电氨基酸疏水作用色谱（HIC）表面疏水性Trp、Phe、Ile、Leu、Tyr、Pro、Met、Val、Ala等疏水性氨基酸反相色谱（RPC）表面疏水性Trp、Phe、Ile、Leu、Tyr、Pro、Met、Val、Ala等疏水性氨基酸金属螯合色谱（IMAC）分子与金属形成配位键His、Trp、Cys亲和色谱特异生物识别作用抗原-抗体，酶-底物，酶-抑制剂等共价结合色谱共价结合巯基（Cys）1、纯化的一般目标和方法首先，自然来源或者重组表达的蛋白质经过一些粗提的步骤（例如：匀浆、离心、硫酸铵沉淀等）成为稳定的可以用于色谱分离的样品。然后进行捕获色谱（capturechromatography），主要目标是浓缩和去除大量的容易去除的杂质，此步最关心的是流速和载量，常采用高载量、快流速凝胶。经过浓缩的部分纯化的样品进行中级色谱（intermediatechromatography），目的是去除较难去除的杂质，此步最关心的是分辨率，常采用高分辨率的细颗粒凝胶。最后为了得到符合要求的最终产品，去除残存的杂质以及目的蛋白的多聚物或者降解片断，进行精制色谱（polishingchromatography），常采用具有高分辨率的凝胶过滤凝胶进行凝胶过滤色谱。2、纯化前的准备工作（1）样品稳定性试验a、测定样品在pH2-9的稳定性；b、测定样品在0-4mol/LNaCl及0-2mol/L硫酸铵中的稳定性；c、测定样品在0-50%乙醇、甲醇中的稳定性；d、测定样品在4-40℃的稳定性；e、室温下静置过夜，测定对蛋白水解酶的稳定性。（2）样品预处理a、去除样品中颗粒物（0.45-0.22微米膜过滤或者10000g离心15分钟）b、去除样品中脂类（10000g离心15分钟或有机溶剂抽提）c、去除样品中核酸（加入核酸酶消化或者使核酸沉淀）d、抑制样品中蛋白水解酶（加入蛋白酶抑制剂、低温下快速第一步分离或在蛋白酶缺陷宿主中表达重组蛋白）表2样品中有害杂质及去除办法杂质害处预防措施颗粒物堵塞柱子，增大反压力0.45-0.22微米膜过滤；10000g离心10-15分钟；细胞匀浆，4000-5000g离心30分钟。脂类封闭介质配基、导致沉淀、导致非特异吸附10000g离心10-15分钟；若目标分子稳定，用有机溶剂抽提核酸高粘度、封闭介质结合位点加入核酸酶消化，或使核酸沉淀蛋白酶降解目的蛋白加入蛋白酶抑制剂；用亲和色谱除去蛋白酶；快速进行第一步分离；低温下进行分离；在蛋白酶缺陷的宿主中表达重组蛋白由于不同的色谱方法的原理不同，其对样品的要求也不相同，所以必须在进行色谱之前，根据特定色谱方法的要求对样品进行进一步的处理。如下表所示：表3不同色谱方法对于样品的要求样品参数离子交换色谱疏水作用色谱凝胶过滤色谱样品体积无限制无限制一般柱体积的1-5%样品量最大理论载量的10-20%最大理论载量的10-20%仅受到样品粘度限制样品粘度约50mg/ml约50mg/ml约50-100mg/mlpH值／盐浓度同平衡缓冲液（低盐）同平衡缓冲液（高盐）仅受介质与样品稳定性限制有机溶剂为减少非特异吸附,可加入有机溶剂(30%)分离后，可用有机溶剂进行清洗仅受介质与样品稳定性限制（3）样品的保存条件：短期储存（小于24小时）a、避免接近或超过样品的稳定极限防止蛋白质变性或沉淀b、在密闭容器中冰箱冷藏较长期储存（数天）a、b、同上c、加入适当的抑菌剂长期储存a、同上b、冰冻或者最好冻干（真空冷冻干燥）保存。3、对每一纯化步骤的评价相关方法的建立a、目的蛋白含量测定酶活性测定、生物活性测定、放射免疫、酶联免疫、免疫电泳、荧光。b、总蛋白含量测定紫外吸收法、Lowry法、Bradford染料结合法（考马斯亮兰G-250）等。c、样品复杂度检测HPLC（离子交换、凝胶过滤、反相）、SDS-PAGE、等电聚焦、毛细管电泳（CE）。4、蛋白质的来源（1）天然蛋白：天然产物中的目的蛋白一般含量很少而且组分极复杂，在分离过程中须采用多个步骤才能去除各种杂质，并应在整个过程中降低蛋白水解酶的活性。（2）重组蛋白：重组蛋白则目标蛋白的丰度较高。重组蛋白主要有三种表达定位：a、细胞质：在这种情况下，必须破坏细胞结构才能得到目的蛋白质，同时伴随着大量核酸和其它上千种宿主蛋白质的释放；在表达量较高的条件下，一般形成包涵体，包涵体含有过表达目的蛋白，且容易通过高速离心分离，但是包涵体的溶解与复性是较复杂的。b、外周质：表达的蛋白质存在于细菌内膜与外膜之间，这样目的蛋白可以较少地受到蛋白酶的作用并减少了宿主蛋白的污染。c、分泌到培养基：这种表达一般蛋白质浓度较低，主要受到培养基中的污染。表4不同来源的蛋白质样品概述来源目的蛋白含量复杂度杂质类型色谱前预处理天然低复杂固体颗粒，杂蛋白，核酸，蛋白酶去除固体颗粒与核酸，抑制蛋白酶重组细胞质较高复杂细胞碎片，宿主蛋白，核酸，蛋白酶去除固体颗粒与核酸，抑制蛋白酶包涵体很高低，主要为目的蛋白高速离心分离，溶解、复性外周质高中等宿主蛋白，蛋白酶去除固体颗粒分泌低低，主要含培养基蛋白培养基，蛋白酶，宿主蛋白去除固体颗粒，抑制蛋白酶三、常用液相色谱纯化方法1、凝胶过滤（gelfiltration，molecularsievechromatography分子筛、sizeexclusionchromatography大小排阻色谱，gelpermeationchromatography凝胶渗入色谱）。根据分子大小和形状进行分离的一种方法，分子量（Stroke半径）较大的先出峰，分子量小的后出峰。最常用的经典凝胶为SephadexG系列，此外还有Sephacryl、Sepharose、Superose、Superdex等凝胶系列。凝胶过滤法方法简单、重现性强，目前广泛应用。凝胶过滤具有很多不同分离范围的凝胶系列供选择。要点:采用细长（L/D~20）的柱、选择合适的凝胶、上样体积较小、流速较慢。表5常用凝胶过滤用凝胶及其基本参数系列名称分离范围颗粒大小应用Superdexprepgrade系列Superdex30PG小于1000024~44微米小肽Superdex75PG3000~7000024~44微米一般蛋白Superdex200PG10000~60000024~44微米单抗、大分子蛋白Superose系列Superose6PG5000~500000020-40微米蛋白、多糖、核酸、病毒Superose12PG1000~30000020-40微米蛋白、多糖、核酸SephacrylHR系列SephacrylS-1001000~1000025-75微米肽类、小蛋白SephacrylS-2005000~25000025-75微米一般蛋白SephacrylS-30010000~150000025-75微米抗体等较大蛋白SephacrylS-400~2800000025-75微米多糖、蛋白多糖、脂质体SephacrylS-500~6000000025-75微米1078bp的DNA片断SephacrylS-1000~10000000040-105微米20000bp的质粒、巨大多糖、病毒SepharoseFF系列Sepharose6FF10000~400000045~165微米质粒、病毒Sepharose4FF60000~2000000045~165微米病毒，rHBsAg等巨大分子SepharosexB（CL-xB）系列Sepharose2B70000~4000000060-200微米大分子复合物Sepharose4B60000~2000000045-165微米病毒等大分子Sepharose6B10000~400000045-165微米大分子SephadexLH系列SephadexLH20100-400030-100微米天然产物SephadexLH60400-2000040-120微米天然产物Sephadex系列SephadexG-10小于70040-120SephadexG-15小于150040-120SephadexG-25coarse1000-5000100-300脱盐及更换缓冲液用SephadexG-25medium1000-500050-150SephadexG-25fine1000-500020-80SephadexG-25superfine1000-500010-40SephadexG-50coarse1500-30000100-300小蛋白、多肽的分离SephadexG-50medium1500-3000050-150SephadexG-50fine1500-3000020-80SephadexG-50superfine1500-3000010-40SephadexG-753000-8000040-120一般蛋白的分离SephadexG-75superfine3000-7000010-40SephadexG-1004000-15000040-120较大蛋白的分离SephadexG-100superfine4000-10000010-40SephadexG-1505000-30000040-120大蛋白的分离SephadexG-150superfine5000-15000010-40SephadexG-2005000-60000040-120大蛋白的分离SephadexG-200superfine5000-25000010-402、离子交换色谱（ionexchangechromatography）蛋白质、多肽均属于两性电解质，在缓冲液pH小于其等电点时，带净正电荷，而在缓冲液pH大于其等电点时，带净负电荷。阴离子交换凝胶本身带有正电荷基团，阳离子交换凝胶本身带负电荷基团。由于静电相互作用而使样品结合到凝胶上，再采用盐浓度梯度或者更换缓冲液的pH值进行洗脱对于等电点小于5.0的酸性蛋白质，推荐使用阴离子交换，对于等电点大于7.0的碱性蛋白质，推荐使用阳离子交换。两种模式：一种使目的蛋白结合凝胶，通过梯度洗脱；