免疫共沉淀原理及注意事项

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）单系金一实验原理以（抗体和抗原）之间的专一性作用为基础的用于研究（蛋白质相互作用）的经典方法。是确定两种蛋白质在完整（细胞内生理性）相互作用的有效方法。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。问题：细胞怎样保持生理状态-不变性？Y-X-抗XCO-IP应用与IP区别测定两种目标蛋白质是否在体内结合确定一种特定蛋白质的新的作用搭档CO-IP与IP只取决于检测焦点是初级靶分子（抗原）还是次级靶分子（相互作用蛋白）实验基本原理1.提取蛋白2.在细胞裂解液中加入抗X的抗体3.孵育后再加入ProteinA或G(于Agarosebead上)若细胞中有与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成复合物：“Y—X—抗X抗体—ProteinA或G3.经变性、聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物又被分开。（xy抗原、x抗体）proteinA/G有一个很重要的特性就是能与抗体的Fc段结合agarosebead琼脂糖珠CO-IP原理图解proteinA/G-琼脂糖珠复合物ProteinA是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质，能特异性地与人和哺乳动物抗体（主要是IgG）的Fc区结合。目前多用proteinA/G预先结合在argarosebeads上。ProteinA/G的作用及具体原理“捕获”抗体，形成复合物，抗体-目的蛋白-ProteinA/Gbeads非共价健结合ProteinA/G-garosebeads共价结合加样缓冲液-煮沸变性-离心ProteinA/Gbeads↓EP管（抗体-目的蛋白-少量非特异性吸附蛋白）。二CO-IP特征优点（1相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态（2蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响（3可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物二CO-IP特征局限性（1可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用（2两种蛋白质的结合可能不是直接结合，有第三者在中间起桥梁作用；（3必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，若预测不正确，实验就得不到结果。三实验流程提取细胞总蛋白↓↓离心，上清电泳(抗原抗体)准备PA珠子，PBS洗3遍↓PA珠子加入蛋白裂解液（去除非特异性蛋白背景)↓离心去PA珠子，取上清↓测蛋白浓度(BCA法)↓加一抗反应(4℃过夜)↓加PA珠子捕捉复合物(室温1h或4℃过夜)↓离心，收集沉淀，预冷RIPABuffer洗3遍↓上样缓冲液悬浮沉淀，加热游离抗原、抗体、珠子↓↓四实验结果分析SDS-PAGEWesternblotting分析质谱分析检测目的蛋白SDS-PAGE结果分析标难曲线只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才具有可靠性。=蛋白样品距加样端迁移距离（cm）溴酚蓝区带中心距加样端距离（cm）相对迁移率以每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁移率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即可测出其分于量。一抗一抗一抗(兔抗Actin)曝光后的蛋白条带二抗(辣根酶标记的羊抗兔IgG)ECLX光片曝光显影ECL试剂含有转印蛋白的PVDF膜++转印膜上蛋白检测示意图WB结果分析CO-IP与质谱分析流程三实验的关键1.实验最需要注意点就是抗体的性质。特别是多抗的特异性是问题。2.为防止蛋白的分解、修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白酶抑制剂，低温下进行实验。3.考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在beads上，残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。4.确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。？？注意的问题：1.裂解液细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或TritonX-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。不能用高浓度的变性剂（0.2％SDS)，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的cocktailer。RIPA裂解液--普利莱基因技术有限公司100mlRIPABuffer：50mMTris-HCl(pH7.4),150mMNaCl,1%NP-40,0.1%SDS.（100元）说明：1.裂解液临用前可新鲜加入最终浓度为1mM的PMSF或其它蛋白酶抑制剂。2.RIPA裂解液中蛋白样品含有较高浓度的去垢剂，不能用Bradford法但可用BCA法或改良Lowry法测定蛋白浓度裂解液成分国内博士：细胞裂解液：50mMTris-HC（lpH7.5），150mMNaCl,0.5%NP-40,1mMEDTA使用前加入PMSF至终浓度1mM、proteinaseinhibitorcocktail（混合物）。刘岩BC300buffer20mMTris-Cl,pH8.0,300mMNaCl,0.2mMEDTA,10%glycerol（甘油）,0.2mMPMSF,0.2%Tween202.1免疫沉淀中抗体的选择注意的问题：2.2抗体使用对照抗体：（阴性和阳性）阴性：单克隆抗体：同一种属的IgG兔多克隆抗体：正常兔IgG阳性：细胞内某种蛋白的抗体（做膜蛋白A，用膜蛋白B）未检测到目得蛋白或蛋白很少可能原因处理方法1.样品被蛋白酶降解：添加蛋白酶抑制剂；所有操作保持4℃以下冰上操作并防止冻融2.抗体浓度太低：调整抗体浓度，必要时设立浓度梯度，摸索最佳浓度3.抗抗体亲合力太低：选用适合于IP和/或IB的相应抗体4.IP抗体未与agarose珠子结合：选用适合于IP的相应珠子，正确保存防止变质或干燥5.Tag未暴露在融合蛋白构象的表面：改变tag融合表达部位6.裂解液严谨度太高：改用低严谨度裂解液目得蛋白高背景：可能原因处理方法非特异蛋白结合在无血清培养液中裂解细胞；在免疫沉淀前用protein(G/A)珠子预洗，免疫沉淀后增加漂洗次数和严谨度（高盐或去垢剂）裂解液严谨度太低改用高严谨度裂解液实验仪器或液体被污染使用洁净的仪器或液体转移膜上的非特异吸附戴手套，用镊子夹取，不要接触膜转移面试剂RIPABuffer蛋白酶抑制剂（aprotinin、leupeptin、pepstatin）、PMSF。洗涤缓冲液PBSProteinAagarose琼脂糖抗体仪器、耗材摇床、EP管、低温离心机、1.5mlEP管、制冰机、移液器、吸头、水浴锅、细胞刮子（乙醇洗干净风干）