第九章-人工合成酵母基因组(二)

BAG-TJUBuildingblock合成与组装李炳志2014-4BAG-TJUTPCRFPCRCloningCSPCRSequencingBuildingblocks合成BAG-TJU引物混合（Oligomixes）TPM（templatelessprimermix）终浓度：300nMOPM（outerprimermix）终浓度：3μMBAG-TJUPCR反应组分•模板：DNA•引物：正向引物与反向引物•dNTPs（脱氧核糖核苷酸混合物）•耐热DNA聚合酶：Taq、pfu、Phusion等•缓冲液（Mg2+）BAG-TJUPCR反应体系组分体积终浓度Template(colonyorDNA)1μgasrequiredM13F(10μM)2μl0.4μMM13R(10μM)2μl0.4μM10×Taqbuffer5μl1×dNTPMixture(2.5mM)4μl0.2mMTaqDNApolymerase(5U/μl)0.5μl0.05U/μlddH2Oto50μlnotapplicableBAG-TJUPCR反应程序957255N个循环BAG-TJU无模板PCR（TemplatelessPCR,TPCR）•TPCR–模板&引物：TPCR引物–酶：高保真酶–程序：•5cycles:94℃,30s；69℃,30s；72℃,15s•5cycles:94℃,30s；65℃,30s；72℃,15s•20cycles:94℃,30s；61℃,30s；72℃,15s•72℃,3min;•4℃,+∞BAG-TJU无模板PCR（TemplatelessPCR,TPCR）•文献中大多称为PCA（polymerasecyclingassembly）•引物等浓度存在，是引物的组装过程，不是扩增过程•产物包含多种大小的基因片段，其中包含全长片段BAG-TJU完成PCR（FinishPCR,FPCR）•FPCR–模板：TPCR产物1:10稀释–引物：FPCR引物–酶：高保真酶–程序：•94℃,3min•25cycles:94℃,30s；55℃,30s；72℃,15s•72℃,3min;•4℃,+∞BAG-TJU完成PCR（FinishPCR,FPCR）FPCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测BAG-TJUFPCR产物与载体的连接•根据琼脂糖凝胶电泳检测结果调整FPCR产物加入量（0.5~4μl）•平末端连接（载体与片段摩尔比=1:3~1:8）BAG-TJU连接体系的大肠杆菌转化蓝白斑筛选•抗性和蓝白斑筛选（IPTG+X-gal）•37℃过夜培养（倒置）BAG-TJU菌落PCR筛选（ColonyscreeningPCR）BAG-TJU测序验证BAG-TJU设计软件()BAG-TJU设计软件BAG-TJU设计软件BAG-TJU…GACCACGGAGCTCGGCGACTACGGAGCGCGGTTCTTGGATCTCTTCTTGTCACGA…TCGAGCCGCTGATGCCTCGCGGGTACGAACCATCTTAGTTGCCAAGAACCTAGAGAAGAA…GACCACGGAGCTCGGCGACTACGGAGCCGGTTCTTGGATCTCTTCTTGTCACGA…TCGAGCCGCTGATGCCTCGCGGGTACGAACCATCTTAGTTGCCAAGAACCTAGAGAAGAACAGTG5’3’5’3’5’3’3’5’1)将~750bp的BB拆分成长约60bp的寡核苷酸链，包含20bp的重叠区，20bp的缺口2)增加或减少重叠区长度以匹配退火温度20bp重叠区Tm=59℃太高—减少重叠区20bp重叠区Tm=48℃太低—增加重叠区19bp重叠区Tm=56℃25bp重叠区Tm=56℃寡核苷酸链设计与退火温度优化设计软件BAG-TJUmutantplasmidrepairedplasmidDpnⅠdigestionaddprimerstransformation=mutationcycleextensionPCR突变修复——环状延伸PCR•DpnⅠ识别甲基化位点GATCBAG-TJUF1R1F2R2F1R2ABABFull-lengthPCROE-PCR突变修复——重叠延伸PCR（OE-PCR）BAG-TJU模板1模板2F1R1PCR片段AF2R2片段BPCR无引物PCR互为模板、引物延伸F1R2延伸PCR目的片段搭桥PCR的原理示意图基因片段的组装——OE-PCRBAG-TJUDNAassemblyinyeast基因片段的组装——酵母组装BAG-TJU5’5’5’5’3’3’3’3’T5外切酶5’5’5’5’3’3’3’3’5’5’5’3’3’3’5’3’碱基互补配对Phusion聚合酶Taq连接酶5’5’3’3’50℃反应1h片段A片段BFR基因片段的组装——Gibson等温组装BAG-TJU总结基因片段的合成合成流程突变修复方法环状延伸PCROE-PCR基因片段的组装OE-PCR酵母组装Gibson等温组装BAG-TJU