第二章-蛋白质分子设计

第二章蛋白质分子设计ChaptertwoProteinDesign引言在人体的进化过程中蛋白质执行了在人体及体外的许多重要任务：酶是催化化学反应的蛋白质或者核酸分子；抗体起到防护的作用;……从生态角度，蛋白质也是非常理想的物质:生物合成不需要消耗很多能量专一性很强不产生副作用并且能很快降解蛋白质没有像化学试剂那样被普遍应用，其原因:(1)蛋白质分子量非常大(10000-1000000)，不能通过化学方法生产;(2)蛋白质的功能是在生理条件下挥发的，在其它条件下(如在有机溶剂中)是不稳定的;(3)专一性致使其应用范围受到影响。蛋白质应用受限的原因蛋白质设计目前存在的问题1、与天然的蛋白质比较，缺乏结构的独特性及明显的功能优越性2、三级结构的确定性较差计算机模拟突变蛋白质产品功能分析基因构建Pr设计循环第一节蛋白质分子设计原理蛋白质分子设计的流程天然蛋白质蛋白质结构预测蛋白质晶体学蛋白质三维结构结构与功能的关系蛋白质突变体设计及结构预测几何优化及蛋白质动力学研究结果分析与原先的结构比较蛋白质合成定位突变分离、纯化及表征新蛋白质数据的输入Pr突变体设计的3个步骤利用计算机模拟技术确定突变位点及替换的aa利用能量优化及动力学方法预测修饰后的蛋白质结构预测的结构与原始的Pr结构比较，利用Pr结构-功能或结构稳定相关知识及理论计算机预测新Pr可能具有的性质在上述的设计工作完成后，要进行合成或突变实验并经分离、纯化及表征后得到所要求的新Pr；Pr设计的成功与否，必须要有理论与实验的紧密相结合在上述的设计工作完成后，要进行合成或突变实验并经分离、纯化及表征后得到所要求的新Pr；Pr设计的成功与否，必须要有理论与实验的紧密相结合蛋白质分子设计原理内核假设。蛋白质的独特的折叠形式是由蛋白质内核中残基的相互作用决定。（内部十分保守的区域）Pr内部都是密堆积（很少有空穴大到水分子可以结合一个水分子或惰性气体），没有重叠所有内部的氢键都是最大满足的（主链和侧链）。蛋白质的氢键形成涉及一个交换反应，溶剂键被蛋白质键所取代疏水及亲水基团需要合理的分布在溶剂可及表面及不可及表面。分布代表疏水效应的主要驱动力蛋白质分子设计原理金属Pr中配位残基的替换要满足金属配位几何。要求围绕金属中心放置合适数目的蛋白质侧链或溶剂分子，并符合正确的键长、键角以及整体的几何。对于金属Pr，围绕金属中心的第二壳层中的相互作用是重要的。氢键的第二壳层通常涉及与蛋白质主链的相互作用。最优的aa侧链几何排列。Pr侧链构象由空间两个立体因素所决定(一是立体势垒，二是aa的位置)结构及功能的专一性。这是Pr设计最困难的问题一、蛋白质分子设计的分类•设计的目的主要有两个：•一是为有目的的蛋白质工程改造提供设计方案和指导性信息，如以此提高蛋白质的热、酸稳定性，增加活性，降低副作用，提高专一性等；•二是探索蛋白质的折叠机理，如简单蛋白质骨架的从头设计是研究蛋白质内相互作用力的类型及本质的很好途径，也为解决蛋白质折叠问题寻找定性和定量的规律。（一）蛋白质分子设计的层次•分为两个层次：•一是在蛋白质三维结构已知基础上的分子设计；•二是在三维结构未知的情况下，借助一级结构序列信息及生物化学性质进行分子设计工作。（二）蛋白质分子设计的分类•1．定点突变或化学修饰法•2．拼接组装设计法•3．从头设计全新蛋白质二、蛋白质分子设计的原则•1．活性设计•2．对专一性的设计•3．Scaffold设计(框架)•4．疏水基团与亲水基团需合理分布•5．最优的氨基酸侧链几何排列溶菌酶结构•例如:鸡卵清蛋白溶菌酶活性分子的设计过程中，其中EFAEEAASF多肽能水解几丁质和葡聚糖，但糖苷酶活性较低。•Cutte成功设计了一个具有明显的核酸酶活性的34肽，该肽可水解下列底物，但活性依次降低：polyC、polyA、polyU、polyG。其主要活性源于二聚体；而天然核酸酶仅消化polyC、polyU、polyA，特别倾向于水解polyC的3’端。•设计步骤蛋白质分子设计步骤图修正设计获得目标蛋白质序列合成检测结构信息分析建立结构模型设计目标蛋白质数据库序列设计•设计α螺旋时，应选择象Leu、Glu等易于形成α螺旋的残基；•设计全β结构时，应选择Val、Ile等易于形成β折叠片的残基；•而在设计转角时常选择Pro-Asn残基对。第二节基于天然蛋白质结构的分子设计基于天然蛋白质结构的分子设计有两类：•一是进行蛋白质修饰或基因定位突变，即“小改”；•二是进行蛋白质分子裁剪拼接，即“中改”。一、定位突变基于天然蛋白质结构的蛋白质分子“小改”是指对已知结构的蛋白质进行少数几个残基的修饰、替换或删除等，这是目前蛋白质工程中最广泛使用的方法，主要可分为蛋白质修饰和基因定位突变两类。（一）定位突变的设计目标及解决方法定位突变常见的设计目标是提高蛋白质的热、酸稳定性、增加活性、降低副作用、提高专一性，以及通过蛋白质工程手段进行结构-功能关系的研究等。Hartley等于1986年完成了一个我们所要的设计目标及解决的办法：•热稳定性•对氧化的稳定性•对重金属的稳定性•pH稳定性•提高酶学性质•引入二硫桥，增加内氢键数目，改善内疏水堆积•把Cys转换为Ala或Ser，把Trp转换为Phe或Tyr•替代表面羧基，把Met转换为Gln、Val、Ile或Leu•替换表面荷电基团，His、Cys以及Tyr的置换•专一性的改变，增加逆转数，改变酸碱度（二）定位突变的种类要进行基因定位突变，改变DNA核苷酸序列，方法有很多种，如基因的化学合成、基因直接修饰法、盒式突变技术等。根据基因突变的方式，分为以下三类：插入一个或多个氨基酸残基；删除一个或多个氨基酸残基；替换或取代一个或多个氨基酸残基。要达到基因定位突变的目的，多采用体外重组DNA技术或PCR方法。（三）定位突变的程序1．建立所研究蛋白质的结构模型可以通过X射线晶体学、二维核磁共振等测定结构，也可以根据类似物的结构或其他结构预测方法建立起结构模型。2．找出对所要求的性质有重要影响的位置•在改造中如何恰当地选择突变残基是一个关键问题，这不仅需要分析残基的性质，同时还需要借助于已有的三维结构或分子模型。3．预测突变体的结构根据所选定的氨基酸残基位点及突变后的氨基酸种类，利用相关软件进行突变体的结构预测，将预测的结构与原始的蛋白质结构比较；利用蛋白质结构-功能或结构-稳定性相关知识及理论计算预测新蛋白质可能具有的性质；同时利用能量优化及蛋白质动力学方法预测修饰后的蛋白质结构，以修正所选择的氨基酸位点和突变后的氨基酸种类。4．构建突变体，获得突变体蛋白依据所设计好的突变，利用化学合成或PCR等方法构建突变体。进行基因测序验证突变体后，将突变体进行表达，纯化蛋白质，获得所设计的新蛋白质。5．突变体蛋白质的检验•测定新蛋白质的序列、三维结构、稳定性、催化活性等，•并与对应的天然蛋白质进行比较，检验突变设计的效果，•同时进一步修正设计方案。蛋白质中功能残基的鉴定根据结构信息确定残基的突变突变方法鉴定突变功能残基利用蛋白质同源性鉴定功能残基（四）蛋白质中功能残基的鉴定1．根据结构信息确定残基的突变•最有效最直接的方法•AlanFersht和GregWinter等测定了酪氨酰-tRNA合成酶突变体的三维结构，通过分析该酶的Cys35被结构相似的丝氨酸所取代后的结构，发现Cys35可能与酪氨酰腺苷酸中间体中的3’羟基形成氢键，突变效应降低了酶的活性，证实了Cys35在结合腺苷酸部分的作用。2．突变方法鉴定突变功能残基•通过引进另外一种突变来检测•随机突变技术•删除分析及连接片段扫描突变3．利用蛋白质同源性鉴定突变功能残基•高度保守的残基与同源蛋白的共同功能以及维持结构有关。•非保守残基是分析的靶位点，特别是对于专一性研究。•探测突变蛋白质的结构整体性质，以鉴定突变残基。（五）定位突变的应用•RNaseT1的结构改造是分于设计中的一个成功实例•T1核糖核酸酶含有104个氨基酸残基，这个天然酶有两对二硫键（Cys2-Cys10，Cys6-Cys100，日本大阪大学的Niskikawa等人在Tyr24和Asn84位引入第三个二硫键，热稳定性增加。例：甲基对硫磷水解酶结构和功能的研究有机磷农药的长期广泛使用已经使很多水体及土壤被严重污染,而且直接影响到人们的身体健康。有机磷水解酶的改造：提高对特定底物的催化效率;扩大底物范围;增加酶的稳定性;DongYJ,2005目的和意义通过对MPH的结晶和三维结构的测定，研究MPH活性中心的结构，并通过定点突变及活性测定来验证，确定MPH的结构和功能的关系,为MPH的改性和利用提供科学的依据和良好的材料。OPH是目前在各方面研究最为透彻的有机磷农药降解酶，同时也是应用最为广泛的农药降解酶，为此对甲基对硫磷水解酶的深入研究将有利于甲基对硫磷水解酶的广泛应用。载体污染序列的分析在进行序列分析时，首先需确定序列是否含有载体序列的污染，如果含有载体序列，需截去后再进行其他分析。在线分析。MatchtoVector:StrongModerateWeakSegmentofsuspectorigin:SegmentsmatchingvectorStrongmatch:1-113,3838-4071bp。真正的目标序列：114~3,837bp。1ThenucleotidesequenceincludingmpdfromPseudomonassp.WBC-32Plesiomonassp.M6的甲基对硫磷水解酶基因匹配区为134~1866，Identities=1720bp／1733bp(99％)CDS:331aa(398-1393bp)3Pseudomonasputida的甲基对硫磷降解蛋白基因匹配区为168~1393，Identities=1025／1026(99％)CDS:341aa(368-1393bp)两个基因的CDS不一致，分别匹配于MPH的398，368-1393bp同源序列搜索（Blastn:114-3837bp）123甲基对硫磷水解酶基因的分析结论：MPH基因的CDS:398—1393（331aa)以1393位的TGA结束的可能的ORF有八个,MW:34.4kD–ATG:368，398bp典型的启动子序列结构:TTGCAA-17个氨基酸-TATACT(320-365bp)典型的核糖体结合位点:AGGA(381bp)MPH与OPH的序列比对二者同源性仅为13.6%，确定MPH是一个有别于OPH的蛋白质。二者在功能上的相似性不能用蛋白的一级序列的相似性加以解释，推测二者功能上的相似性与其一级序列构成的高级结构中活性中心结构的相似性有关。MPH信号肽的分析预测：神经网算法结论：信号肽（1-35氨基酸）。C值表示切割点的可能性，S值表示具有信号肽的可能性MPH信号肽的分析预测：马尔可夫算法信号肽的一般结构为：正电荷的n-region；疏水的h-region；中性极性的c-region。MPH具有典型的信号肽的三部分结构结论：可能的信号肽为1-35氨基酸。su75001:1_UV0200400600800100012001400mAU0.05.010.015.020.0mlmlmAUMPH的凝胶过滤柱层析图MPH的SDS-PAGE分析Buffer(ug/ml)MPH(ug/ml)Ni4.1484.370Mg14.34515.060Mn0.0750.497Fe1.1582.388Co0.0500.040Cu10.8129.296Zn0.201272.122MPH中金属种类及含量的测定MPH的浓度：0.217mg/ml,结论：MPH中含锌离子硒代蛋氨酸MPH的表达纯化在诱导表达时添加高浓度的与蛋氨酸有共同的合成途径的终产物赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸，以及与赖氨酸具有相互协同作用的苯丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸来抑制正常菌株中蛋氨酸的合成，迫使细菌利用培养基中外源添加的硒代蛋氨