细菌培养基配制及灭菌操作

实验教案课题(项目)名称:细菌培养基配制及灭菌操作计划学时:6实验类型:1.演示性□2.验证性□3.综合性√4.设计性□5.其它□授课日期:年月日第周星期第节实验三细菌培养基配制及灭菌操作一、目的要求1．明确细菌培养基的配制原理；2．通过对培养基的配制，掌握配制细菌培养基的一般方法和步骤；3．了解细菌在细菌培养基上的培养过程。二、基本原理培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，含有牛肉膏、蛋白胨和氯化钠。其中牛肉膏为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素，而氯化钠提供无机盐。牛肉膏蛋白胨培养基的配方如下：牛肉膏3.0g蛋白胨10.0gNaCl5.0g水1000mlpH7.4-7.6三、器材1．菌种、溶液或试剂琼脂，1mol/LNaOH，1mol/LHCl；牛肉膏蛋白胨培养基。2．仪器或其他用具试管，三角瓶，烧杯，量筒，玻棒，培养基分装器，天平，牛角匙，高压蒸气灭菌锅，pH试纸(pH5.5～9.0)，棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等。四、操作步骤1．称量按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。也可放在称量纸上，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净、擦干，再称取另一药品，瓶盖也不要盖错。2．溶化在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如果配制固体培养基，将称好的琼脂放入已溶化的药品中，再加热溶化，在琼脂溶化的过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底使烧杯破裂。最后补足所失的水分。3．调pH在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/LNaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH值，直至pH达7．6。反之，则用1mol/LHCl进行调节。注意pH值不要调过头，以避免回调，否则，将会影响培养基内各离子的浓度。对于有些要求pH值较精确的微生物，其pH的调节可用酸度计进行4．过滤趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利结果的观察。一般无特殊要求的情况下，这一步可以省去（本实验无需过滤）。5．分装按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。(1)液体分装分装高度以试管高度的1/4左右为宜。(2)固体分装分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。(3)半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。6．加塞培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。7．包扎加塞后，将全部试管用麻绳捆扎好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、日期。三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别、日期。8．灭菌将上述培养基以1．05kg/cm2（15磅/英寸2），121．3℃，20分钟高压蒸汽灭菌。9．搁置斜面将灭菌的试管培养基冷至50℃左右，将试管棉塞端搁在玻棒上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。10．接种培养五、实验报告包括如下内容，写作规范严格按照统一的要求：（1）实验目的（2）实验原理（3）实验所需仪器设备及用品（4）实验步骤（5）实验阶段性结果（6）实验结果与分六、实验注意事项1、高压蒸汽灭菌步骤及注意点：（1）首先将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水。（2）放回灭菌桶，并装入待灭菌物品。（3）加盖，以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓。（4）水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀。（5）当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用1．05kg/cm2，121.3℃，20分钟灭菌。（6）灭菌所需时间到后，切断电源或关闭煤气，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至0时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，（7）将取出的灭菌培养基放入37℃温箱培养24小时，经检查若无杂菌生长，即可待用。2、加热溶化过程中，要不断搅拌，以固体物质粘在烧杯底上烧焦，造成烧杯破裂，加热过程中所蒸发的水分应补足。3、培养基的灭菌时间和温度，需按照各种培养基的规定进行，以保证杀菌效果和不损失培养基的必要成分，培养基灭菌后，必须放在37ºC温箱培育24h，无菌生长方可使用。4、培养基的pH要调合适。5、细菌接种过程必须保证在无菌状态下进行。七、思考题1、培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是无菌的？2、在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题？为什么？3、配制合成培养基加入微量元素时最好用什么方法加入？天然培养基为什么不需要另加微量元素？4、有人认为自然环境中微生物是生长在不按比例的基质中，为什么在配制培养基时需要注意各种营养成分的比例？