免疫沉淀(Immunoprecipitation)实验操作方法

免疫沉淀（Immunoprecipitation）实验操作方法实验原理：免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）是利用抗原和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质如proteinA/G特异性地结合到免疫球蛋白（抗体）FC片段的现象而开发出来的特异分离富集抗原的方法。目前多用预先结合固化在Agarosebeads上的proteinA/G（Agrose-proteinA/G），使之与抗体结合，再通过抗体特异性结合抗原而形成Agrose-proteinA/G、抗体、抗原复合物，利用Agarosebeads的重量，通过离心即可特异分离富集目的抗原。实验步骤：1.处理细胞：依据实验目的，设计实验，处理好细胞模型。一般3×106细胞/处理(即六孔板一个孔，约200ug总蛋白)。2.配IP裂解液：200ul/孔（6孔板），并加入蛋白酶抑制剂，如果蛋白磷酸化水平影响实验结果则应加入磷酸酶抑制剂。注意抑制剂的要现加现用。3.收集细胞：冰上操作，裂解细胞前用1×PBS（4度）洗1遍，每孔加入200ulIP裂解液，冰上静置5分钟后刮下细胞并收集至EP管中。4.超声：强度37％，5秒×4次（程序07）。目的是使细胞裂解更完全并打断基因组DNA,但可能会影响蛋白质之间的相互作用，进行共免疫沉淀实验时要注意这一点。5.离心细胞裂解液：4度10000rpm10分钟。6.Agrose-proteinA/G清洗：一般1ug抗体对应15ulAgrose-proteinA/G（不同公司产品可能不同，注意结合说明书及实验结果考虑），预清洗细胞裂解液的Agrose-proteinA/G用量与结合抗体的用量一致。取相应量的Agrose-proteinA/G到EP管中（剪枪头）并用500ul1×PBS（4度）洗两遍，5000rpm×2分钟，吸掉上清备用。7.细胞裂解液预清洗：为去除非特异作用，细胞裂解液先用Agrose-proteinA/G预清洗。转移步骤5离心好的细胞裂解液上清至步骤6洗好的Agrose-proteinA/G中，4度翻转1小时。8.抗体和Agrose-proteinA/G预孵育：为减少游离抗体消耗抗原造成IP效率下降，将抗体和Agrose-proteinA/G进行预孵育。在步骤6洗好的Agrose-proteinA/G中加入200ul含0.1%BSA的IP裂解液及相应量的抗体，4度翻转1小时。不同抗体时间可能有不同。9.抗原抗体孵育：步骤7和8后进行离心（5000rpm2分钟），将预清洗好的细胞裂解液转移到含预孵育好的抗体和Agrose-proteinA/G的EP管中，4度孵育过夜。10.洗IP复合物：步骤9后离心（5000rpm2分钟），吸掉上清，加入IP裂解液（一般不用加抑制剂）500ul，弹匀后4度摇转5分钟，重复6次。最后一次离心后加入3×SDS60ul。11.WB检测。附注：IPlysisbufferTris50mMPH7.4NaCl:150mMEGTA2mMEDTA1mMTritonX-1001%磷酸酶抑制剂：Pyrophosphate2.5mMGlycerolphosphate1mMNa3VO41mM蛋白酶抑制剂：PMSF1mMLeupeptin1ug/mlAprotinin5ug/mlIPlysisbufferReagentFinalconcentrationQuantityTris-base(FW121.1)50mM0.6055gNaCl(FW58.44)150mM0.8766gEDTA(0.5M)1mM0.2mlTriton1%1mlHCl(FW36.46)adjusttopH7.4ddH2OMakeupto100mlNaF(FW:42g/mol)50mM*500.105g/ml焦磷酸钠(265.9g/mol)2.5mM*1000.067g/ml